浅谈均相时间分辨荧光-HTRF技术
发展背景
现代免疫分析方法期初较早的形式是放射免疫分析法，但该法最大的缺陷是其带来的放射性污染对实验人员和环境有很大危害，因此现代免疫分析中采用放射性同位素作为标记物的方法所占的比例正在迅速减少。随着科学研究的不断深入，多种非放射性免疫分析技术进入了人们的视野，如荧光偏振免疫分析、酶联免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、生物发光分析、化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析等。今天小备就给大家介绍下高通量药物筛选神器均相时间分辨荧光-HTRF技术。
基本原理：
HTRF(均相时间分辨荧光)是用来检测均相体系中待测物的一种最常用的方法，是用来研究药物靶标的理想的平台。这种技术结合了荧光共振能量转移(FRET) 和时间分辨技术(TR)。在TR-FRET实验中，当供体和受体相离很近时，在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。采用双波长检测能够显著减小缓冲液和培养基的干扰，最终的信号跟产物形成的量成比例。
一、时间分辨荧光
时间分辨荧光（TRF）利用了稀土元素中镧系元素的独特性质：
镧系元素与普通荧光相比，其半衰期更长，比普通的荧光物质半衰期长5或6个数量级，因而可用时间分辨荧光检测仪在激发后延迟一定时间后再测量，有效避免了非特异性荧光的干扰（图1）。同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量转移技术利用了两种荧光基团的能量转移：能量供体和能量受体。供体被外来光源激发（例如氙灯或激光)，如果它与受体比较接近，可以将能量共振转移到受体上，使其受到激发，发出特定波长的发射光（图2）。如果将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，那么生物分子的结合可以将供体和受体拉到足够近的距离，从而产生能量转移。
HTRf是目前应用较广泛的技术，应用在GPCRs配体结合、细胞水平的蛋白激酶实验、蛋白磷酸化、生物治疗药物研发、蛋白互作、生物因子或者趋化因子等研究领域。
HTRF实验技术特点
1、与其他实验相比节约时间：不需要清洗流程
2、适用于小分子和大分子复合物的互做；
3、适用于低到高亲和力的相互作用；
4、信号稳定：实验灵敏度和重复性高于ELISA和WB；
5、可批量进行实验。
HTRF技术在激酶中的应用：
一、丝苏氨酸激酶（STK）和酪氨酸激酶（TK）
乐备实酪氨酸HTRF技术服务平台适用于所有酪氨酸激酶的检测，试剂盒提供生物素标记的底物、Eu标记的磷酸化位点特异性抗体、XL665标记的亲和素以及缓冲液。激酶将底物磷酸化，Eu-Ab识别磷酸化底物，XL665-SA与底物上的生物素结合。Eu与XL665接近，产生HTRF信号。
STK激酶活性检测检测服务
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丝苏氨酸激酶HTRF检测服务S1
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二、周期蛋白依赖性激酶（CDKs）
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周期蛋白依赖性激酶（CDK 9）HTRF检测服务
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周期蛋白依赖性激酶（CDK2/5）HTRF检测服务
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周期蛋白依赖性激酶（CDK 1 4 6 7 12）HTRF检测服务
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三、非活性的激酶的抑制剂筛选
乐备实非活性的激酶的抑制剂筛选技术适用于活性低和非活性状态的激酶结合实验。基于HTRF技术原理，提供标记荧光供体的标签抗体（GST/His/Biotin）和三种标记荧光的激酶配体，可覆盖80%的激酶种类，采用竞争法检测模型，可检测待测物与激酶的特异性结合、药效学和动力学。试剂盒同样适用于靶蛋白是激酶的PROTAC小分子的研究。
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