项目文章 | JECCR：中国医科大学发现乳腺癌耐药中 lncRNA CBR3-AS1 作用机制

2021 年 1 月，中国医科大学药学院高华、魏敏杰教授和赵琳教授为共同通讯作者，在 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (IF: 11.161) 杂志发表了题为“LncRNA CBR3-AS1 regulates of breast cancer drug sensitivity as a competing endogenous RNA through the JNK1/MEK4-mediated MAPK signal pathway”的研究论文，报道了 lncRNA CBR3-AS1 在乳腺癌耐药中的分子机制。

中国医科大学张明和王岩为共同第一作者，文章中 lncRNA 芯片实验和分析由欧易生物协助完成。

研究背景

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，阿霉素（ADR）被认为是治疗乳腺癌最有效的药物之一。但在治疗过程中，经常出现 ADR 耐药性，并且其耐药机制尚不清楚。lncRNA 参与了许多与肿瘤癌变和耐药相关的生物学过程，但 lncRNA 在 ADR 耐药过程中的作用尚待研究。

研究内容

本研究通过比较药物敏感/抗性的乳腺癌细胞，鉴定到一个 lncRNA CBR3-AS1。CBR3-AS1 在乳腺癌组织中表达显著升高，与预后不良密切相关。CBR3-AS1 过表达促进了乳腺癌细胞体内外的 ADR 耐药。在机制上，CBR3-AS1 与 MAPK 通路的 MEK4 和 JNK1 竞争性结合 miR-25-3p，以 ceRNA 机制在乳腺癌化疗耐药中发挥关键作用。CBR3-AS1 有望作为乳腺癌靶向癌基因和治疗性生物标志物。

研究结果

1. CBR3-AS1 在耐药乳腺癌细胞中上调，并与药物敏感性和预后不良相关

为了研究 lncRNA 在乳腺癌耐药中的作用机制，利用 lncRNA 芯片，对耐药性的 MCF-7/ADR 细胞进行了检测（图 a-c）。从差异表达的 lncRNA 中挑选了 5 个之前未见报道的 lncRNA 进行了 RT-PCR 验证，其中 CBR3-AS1 表达量最高（图 d），并且 CBR3-AS1 表达量与多种乳腺癌细胞的 ADR 抗性呈现正相关（图 e-g）。同时，TCGA 数据分析显示，CBR3-AS1 在乳腺癌组织中高表达（图 h），并且 CBR3-AS1 高表达伴随较差的临床预后（图 l-n）。

2. CBR3-AS1 对乳腺癌细胞药物敏感性的影响

为进一步研究 CBR3-AS1 作用机制，在 MCF-7 细胞中过表达 CBR3-AS1。结果显示，过表达 CBR3-AS1 显著降低了细胞中 ADR 的浓度（图 c），并且细胞对药物敏感性降低（图 e），克隆形成能力增强（图 g），细胞凋亡下降（图 i）。而与之相反，在 MCF-7/ADR 细胞中 siRNA 干扰 CBR3-AS1，结果显示细胞中 ADR 浓度上升（图 d），药物敏感性增强（图 f），克隆形成能力降低（图 h）。

3. CBR3-AS1 通过 miR-25-3p 调控 MEK4/JNK1 表达

生物信息分析预测显示，CBR3-AS1 可以结合多个 miRNAs，其中的 miR-25-3p 已报道与化疗耐药相关（图 a）。RT-PCR 显示 MCF-7/ADR 中 miR-25-3p 表达下调（图 b）。利用 miRdb 预测和荧光素酶报告实验显示，miR-25-3p 可以直接靶向结合 MAPK 通路的 JNK1/MEK4（图 d-e）。

RNA pulldown 实验表明，CBR3-AS1 可以直接结合 miR-25-3p（图 f-g）。RT-PCR 和 WB 实验显示，在 MCF-7 细胞中过表达 CBR3-AS1 可以显著提高 JNK1 和 MEK4 的表达（图 i-j），而 MCF-7/ADR 细胞中沉默 CBR3-AS1 则会下调 JNK1 和 MEK4 的表达（图 k-l）。

综上所述，CBR3-AS1 可以通过 miR-25-3p 调控 MEK4/JNK1 的表达。

4. 沉默 JNK1 或过表达 miR-25-3p 可以恢复 ADR 药物敏感性

进一步实验显示，过表达 miR-25-3p 或沉默 JNK1，可以逆转由于 CBR3-AS1 过表达所引起的 ADR 药物敏感性的降低（图 a）、克隆形成能力的增强（图 b）、细胞凋亡的下降（图 c）。过表达 miR-25-3p，可以逆转由于 CBR3-AS1 过表达所引起的 JNK1/MEK4 的激活（图 d-e）。

5. CBR3-AS1 过表达促进了乳腺癌细胞对 ADR 的耐药

为进一步在体内验证上述结论，将过表达 CBR3-AS1 的 MCF-7 细胞接种到裸鼠。结果显示，裸鼠体内过表达 CBR3-AS1 后，肿瘤组织内 miR-25-3p 表达量下降（图 c），JNK1 和 MEK4 表达上升（图 h-i）。过表达 CBR3-AS1 可以抵抗 ADR 对肿瘤细胞的抑制作用，而抑制 JNK1 可以逆转这种抑制作用（图 d）。JNK1 抑制同样可以逆转 CBR3-AS1 对肿瘤大小和重量的促进作用（图 e-g）。以上结果表明，CBR3-AS1 可以在体内通过 JNK1/MEK4 促进乳腺癌 ADR 耐药。

研究结论

本研究表明，CBR3-AS1 有望作为评价乳腺癌患者预后的重要生物标志物。CBR3-AS1 通过与 JNK1/MEK4 竞争性结合 miR-25-3p，激活 MAPK 信号通路，提高了乳腺癌对 ADR 的抗性。CBR3-AS1/miR-25-3p/JNK1/MEK4 轴为乳腺癌耐药机制的深入研究提供了理论支持，为寻找新的乳腺癌诊断标志物和特异性治疗靶点提供了理论支持。

参考文献

Zhang M, Wang Y, Jiang L, et al. LncRNA CBR3-AS1 regulates of breast cancer drug sensitivity as a competing endogenous RNA through the JNK1/MEK4-mediated MAPK signal pathway. J Exp Clin Cancer Res 2021; 40(1): 41.

说明：本文源自欧易生物微信公众号