一本关于讲述狼群重返黄石国家公园，以及其引入、研究与管理，讨论狼群今日面临的挑战的专著。

编者：Douglas W. Smith, Daniel R. Stahler, Daniel R. MacNulty

下面是书正文第三部分：

上接： 

（基本为阅读时顺带搞的 无太多修正的纯机翻，机翻味比较浓，感兴趣可以凑活看看）

黄石狼在遗传学研究的最前沿

狼302M迅速穿过公路，来到浮岛湖的冰面上。它短暂地停下脚步，回头看了一眼北方，然后离开视线进入树林，几乎没有注意到那些停下来欣赏这一典型的黄石狼景象的车辆。那是2003年的繁殖季节，302M正在从它在黑尾鹿高原的出生地到拉马尔谷进行看似战略性的巡视，那里有潜在的配偶在等待。就在几天前，黄石狼项目在拉玛尔山谷的山上捕获了302M，并对其进行了追踪。在处理过程中，包括安装无线电项圈和测量体型，从它身上抽血并将其放入多个样本管。对于在黄石公园合作研究狼的生物学家、遗传学家和疾病生态学家团队来说，302M的血液可能是液体黄金，就像多年来所有其他狼的血液样本一样。这些血液不仅提供了302M的营养、激素和基本健康状况以及他所接触的各种疾病的快照，而且还产生了他生命的遗传密码--他的DNA。本章详细介绍了分子遗传技术在黄石狼研究中的应用。但首先，我们要回顾一下基本的生物学原理，当像302M这样的狼带着它特有的犬科动物特征进入我们的视野时，我们到底在看什么。

狼的身体构造是由数以万亿计的细胞组合而成的。这些细胞中的每一个（除了少数例外）都包含相同的基因组，由两股复杂的DNA组成，由核苷酸对组成的链子构成。在302M的大多数细胞中，每个细胞核包含39对染色体（人类有23对）。这些染色体承载着302M这个生物体的蓝图，即狼。黄石公园狼的血统告诉我们，302M从它的母亲7F那里得到了一套39条染色体，另一套39条染色体来自它的父亲，利奥波德狼群的2M。每套39条染色体包含约19,000个蛋白质编码基因，代表近30亿个碱基对的DNA，其中大部分在其他哺乳动物，包括我们身上都有相似的基因。这种生物材料代表了302M的遗传成分，或他的基因型。它的基因为特定的蛋白质编码，这些蛋白质在各个细胞中表达，并为它的特征提供生物编码，如它的皮毛的黑色，它的身体大小，以及它在犬瘟热爆发时的生存潜力。从302M被父母怀上的那一刻起，到我们看到它在冰冻的黄石湖上小跑的那一天（图7.1），它可观察到的特征，或称表型，都是它的基因在其组织和器官的细胞中不同表达的结果。重要的是，他的表现型是他的基因与周围环境相互作用的产物。从他在子宫内开始与他的胎儿一起成长，到他参加的体力要求很高的马鹿狩猎，再到他在领地争夺战中面临的挑战和回报，302M的基因表达了它们的潜能，以示回应。这些基因与环境的相互作用使每只狼成为独特的个体。这个例子，简而言之，不仅描述了狼的基本生物框架，而且描述了地球上所有的生命。有了这个关于狼的遗传构成的基本描述，本章将概述遗传学在黄石公园狼的故事中所扮演的角色，以及它们对不断进步的分子研究领域的前沿贡献。

温泉之源：狼的分子遗传学研究方法

在黄石公园消灭狼后的近四十年里，在下间歇泉盆地发现了一个新的微生物物种，彻底改变了分子生物学的世界（Guyer和Koshland 1989年；Varley 1993年）。这个微生物物种是一种喜热的细菌，即水生热菌，它产生一种被称为Taq聚合酶的热稳定酶。Taq聚合酶的非凡之处在于，它使科学家能够在实验室里通过一系列简单的步骤，包括加热和冷却DNA，大规模地复制DNA。只有适应温泉环境的细菌才能产生这种热稳定的聚合酶，并在这些剧烈的温度波动中进化。Taq聚合酶作为年度分子（1989年）登上了《科学》杂志的封面（Guyer和Koshland 1989年），Taq聚合酶、相关产品和设备的商业销售创造了数十亿美元的收入。使用Taq聚合酶的DNA扩增过程（聚合酶链式反应，或PCR）的发明者Kary Mullis于1993年被授予诺贝尔奖。自20世纪80年代以来，PCR已经彻底改变了法医、人类医学、传染病以及分子和群体遗传学领域。在一连串引人入胜的事件中，一个适应黄石公园严酷地热水域的不起眼的物种的发现，为生命树上的许多生物打开了科学调查的大门，并强调了生物多样性对人类社会的重要性。

除了对我们自己物种的明显好处外，我们不需要再去看犬科（包括狼、狗、郊狼、胡狼和狐狸的家族），就可以看到这种分子技术是如何促进我们对生态学、演化与保护的理解的。从解开类似狼的犬科动物的复杂演化历史和狗的驯化起源，到揭示基因的结构和功能，再到解决对犬科动物保护有意义的问题，很少有非人类物种像犬科动物那样处于遗传研究的前沿。此前，Wayne和Vilà发表了对狼的遗传研究的初步分子方法的全面分析（Wayne和Vilà 2003），而Wayne（2010）综合了类狼犬科的种群遗传学的最新进展。后者强调了21世纪基因组学革命的应用及其与狗基因组计划的关联（LindbladToh等人，2005；Kohn等人，2006），这促进了新分子标记和分析技术的发展。将传统的和新出现的分子技术应用于黄石国家公园狼的研究，使这个种群处于一个特别明亮的聚光灯下。

黄石国家公园狼的遗传工作开始于在它们被释放到野外之前收集每个创始个体的DNA样本。在这之后，建立了一个对创始者的数百个后代的采样协议。从一开始，我们就努力从所有在捕捉和无线电追踪活动中处理过的狼身上采集血液（图7.2），以及从所有回收的狼的遗骸上采集组织。从所有这些样本中提取DNA并储存起来，用于各种分子应用。除了这种基因采样，狼计划团队一直致力于收集各种种群学、生命史、形态学、行为学、疾病和生态学数据集。对任何野生物种来说，在相当长的时间内整合如此丰富的数据是很少见的，更不用说对一个由已知创始者及其后代组成的重新引入的种群。

在过去的二十年里，分子工具和技术的进步，以及它们在生态学、演化学和行为学研究中的应用，得到了极大的发展。自从狼群回到黄石国家公园后，我们使用各种分子标记和方法评估了个体的基因型。我们利用PCR技术对个体从父母那里继承的核DNA进行扩增和测序，对核基因组中被称为微卫星位点的短重复DNA片段和单核苷酸多态性（简称SNPs）进行调查，并对整个基因组进行测序。微卫星通常是高度可变的，对于解决最近的种群动态，如狼之间的亲缘关系和扩散模式极为有用。这些信息被用来通过亲子关系的分配来估计繁殖成功率。然而，使用这种重复性DNA的一个缺点是，它在可以调查的基因组的比例方面是有限的。通常，一项研究只包括8-40个基因座，这是基因组的一个极小的部分。这就限制了对演化化模式、复杂的种群结构、甚至像狼这样的密切亲属结构的种群的亲子关系作出推断的能力。在黄石公园也对狼的SNP位点的变化进行了调查。SNP是在一个种群中分离等位基因（基因的变异形式）的可变位点，可以在整个基因组中进行基因分型。SNP基因分型可以提供有关基因组区域的有价值的信息，这些区域包含与适应性有关的最新变化或在长期演化过程中稳定地保存下来。最后，黄石公园的狼的基因组测序已经成为对科学的一个重要贡献。通过这种方式，我们可以扫描整个近30亿个核苷酸的集合，解决类似的问题，但分辨率更深。这种方法还允许对那些在个体所面临的特定生物或环境条件下表达或转录的基因进行测序。总之，这些遗传标记使我们能够探索从种群结构和基因流到血统关系、被毛颜色的动态、生活史策略和基因组的自然选择等问题。

从血统到种群结构

推断黄石狼的家谱关系的能力引起了广大公众和科学家的共鸣，他们试图利用家谱的信息力量。正如许多人通过家谱与自己的人类祖先联系起来一样，成千上万的人通过连接个人多代的家庭关系来庆祝黄石狼的遗产。这些亲属关系中的许多可以通过实地观察积累的机构知识来推断。例如，在2月份对特定的繁殖对进行观察，然后是雌性的怀孕、筑巢和幼崽的哺乳，这些具体的行为观察可以可靠地表明亲子关系。然而，有时这种知识对于存在复杂繁殖行为的群体来说是不精确的，或者是无法获得观察数据的群体。在这里，基于分子分析的力量被用来测试狼群之间的遗传关系。在黄石国家公园，将实地观察的信息与遗传数据相结合，对于破译狼群的谱系关系至关重要。

第一个关于黄石狼的开创性遗传研究使用了26个微卫星位点的基因型来评估200个个体的遗传关系，并推断亲子关系、繁殖对特征和狼群结构的模式（vonHoldt等，2008）。根据微卫星数据，我们重建了一个种群谱系，将创始人与他们的许多后代联系起来，直到恢复的第一个十年。这种重建使我们能够评估狼群形成和解体的细节，并确定狼群之间的亲属关系。了解狼的谱系结构如何影响行为、种群和遗传变异，也为评估濒危物种恢复的成功提供了一个难得的机会。vonHoldt等人（2008）的工作发现，在恢复的第一个十年里，随着狼种群的扩大，狼保持了高水平的遗传变异和低水平的近亲繁殖。

狼群恢复的遗传成功有赖于几个因素。首先，创始种群是相对较大的，而且在遗传上具有多样性，因为它包括来自加拿大两个来源种群的不同狼群的个体，以及来自蒙大拿州西北种群的混血。我们可以看看其他狼群所面临的遗传挑战，如皇家岛、斯堪的纳维亚半岛和美国西南部的狼种群，这些狼种群是由少数创始个体建立的（Wayne等人，1991；Hedrick等人，1997；Liberg等人，2005）。因此，这些种群的近亲繁殖导致了较低的遗传多样性和个体健身损失，其结果是种群表现较差。狼的这种模式反映了一些动物和植物种群的数据，表明近亲繁殖会对生存、繁殖以及对疾病和环境压力的抵抗力产生负面影响（Keller and Waller 2002）。这些负面影响主要是由于当近亲繁殖时，有害的隐性性状和有害的基因会有更大的机会表现出来。从足够数量的多样化和没有亲缘关系的创始狼开始，可以最大限度地减少新建立的狼种群面临的遗传挑战。

除了具有遗传多样性的基础种群外，遗传变异的维持还取决于各种避免近亲繁殖的行为机制。亲属识别和避免近亲繁殖的选择被认为在生活在家庭群体或合作繁殖的物种中更为发达（Pusey和Wolf 1996）。事实上，对黄石公园狼繁殖对的遗传关系分析表明，狼尽可能避免与亲属交配（vonHoldt等人，2008），Smith等人（1997）对德纳利国家公园和苏必利尔国家森林的近亲狼种群也发现了这一点。鉴于狼的社会结构，个体更有可能在其出生的群体内遇到近亲，而更有可能在出生群体外遇到无亲缘关系的个体（Geffen等人，2011）。因此，对于狼和其他社会性物种来说，远离母群的扩散在一定程度上反映了在避免与亲属近亲繁殖的同时获得配偶的适应性反应（Greenwood 1980; Pusey and Wolf 1996）。黄石公园的遗传和行为学工作表明，近亲繁殖的避免是通过各种扩散、繁殖策略和群体形成模式来实现的（vonHoldt等人，2008）。具体来说，vonHoldt等人（2008）的工作提供了一个新的视角，即一个濒危食肉动物恢复的社会集合规则。在这里，我们可以追踪最初的繁殖对的建立，以及因此而形成的新的繁殖对和群体的规则。随着种群和景观上繁殖者数量的增加，近亲繁殖的避免和成功繁殖的群体的建立在恢复的最初十年里保持了高遗传多样性。

重要的是要记住，黄石国家公园的狼并不代表单一的、孤立的种群。相反，它们是大黄石生态系统种群的一部分，而大黄石种群只是落基山脉更大种群中的一个部分。撇开保护和生态目标不谈，长期的遗传生存能力依赖于这一事实。遗传连接性是落基山脉北部狼剔除的主要规定之一（USFWS 1994a, 2008）。这是因为遗传多样性的亚种群保持着足够的规模，并通过扩散连接起来，对与近亲繁殖、小规模和隔离有关的健康成本更有弹性，并能更好地适应不断变化的环境条件（Keller和Waller 2002）。为了评估重新引入后洛矶山脉北部是否存在一个遗传多样性的亚种群网络，我们使用分子技术分析了555只洛矶山脉北部狼的DNA样本，包括爱达荷州和黄石国家公园的所有66只重新引入的创始者。与黄石公园的研究一样，vonHoldt等人（2010）利用恢复初期十年间26个微卫星位点的变异来证明，落基山狼作为一个整体保持了高水平的遗传变异，近亲繁殖水平较低。与在黄石国家公园发现的因素相似，如多样化的创始种群、快速的种群增长和近亲繁殖的避免，影响了这些模式。

此外，整个落基山脉的狼显示出遗传模式或遗传结构，这在很大程度上确定了个体来自于它们被采样的特定恢复区（即大黄石地区、爱达荷州中部、蒙大拿州西北部）。总的来说，三个恢复区的狼之间的区别很快就形成了，尽管它们是来自加拿大类似的源种群。这种遗传结构，以及来自血统、亲属关系分析和独特的等位基因的信息，使研究人员能够检测到恢复区之间的扩散事件和个体的繁殖（vonHoldt等人，2010）。vonHoldt等人(2010)的研究发现了21个移民，在所有三个恢复区发现了混杂的个体(移民的后代)，并证明了在恢复的第一个十年中基因上有效的扩散(即在扩散后繁殖的个体)。vonHoldt等人（2010）利用血统和亲缘关系数据来识别家族群体（父母-后代和兄弟姐妹），并将这些血统追溯到源种群，估计在三个恢复区中，每一代至少有5.4个有效扩散者。对于该地区的狼来说，狼的世代时间，即两个连续的世代之间的平均时间是4.2年。

然而，迁移并没有在恢复区之间均匀地发生。例如，从爱达荷州中部扩散到大黄石生态系统，导致在怀俄明州公园东南部发现扩散者（和混杂的后代），但在蒙大拿州西北部和黄石地区之间没有发现扩散者的交流。此外，在恢复的第一个十年中，没有发现有效的扩散到黄石国家公园。在怀俄明州采样的6个混血个体中，有4个与来自爱达荷州的扩散狼B58有明显关系，后者在黄石公园的东南方向定居。在本研究期间，黄石公园内的高狼密度和领地饱和度可能限制了个体有效地扩散到这个核心区域的能力（vonHoldt等人，2008）。在黄石公园外，由于人类的影响，狼的生存率和狼群稳定性较低（Smith等人，2010），建立领地和寻找繁殖位空缺的机会可能更大。尽管整个地区的扩散模式有些不对称，但对基因流的最低估计表明，遗传连接的水平足以确保遗传健康的维持。鉴于狼的高扩散能力以及相对于其他处于危险中的脊椎动物物种而言，它们对自然和人为死亡因素的人口弹性（Mech and Boitani 2003b），这一发现并不令人惊讶。然而，这项研究通过分子遗传学的范围为狼的景观生态学提供了巨大的洞察力，为将来评估遗传结构和连接性提供了一个基线和方法。

由于这项分析只涵盖了落基山脉北部狼种群恢复的第一个十年，目前的遗传状况还不清楚。但鉴于2015年的狼群估计至少有1700只，是研究期结束时的两倍多，因此，目前整个地区可能正在发生更大的基因流动。我们还记录了更多迁移到公园的案例，并有一些成功繁殖的证据（例如，8英里狼群的创始者）。这些事件可能是由于过去十年公园内狼的密度较低，这可能使黄国家石公园的“狼堡”更容易被扩散者攻破。归根结底，北落基山狼的遗传健康的特点可以归结为最初的重新引入规划、低水平的近亲繁殖和种群扩张。美国西部狼的长期生存管理将需要维持足够的种群规模和自然扩散的动态。成功与否将部分取决于狼的死亡率，这在很大程度上受到人类和栖息地条件的影响（Oakleaf等人，2006；Murray等人，2010；Smith等人，2010）。但是，成功已经并将继续受到像黄石国家公园这样大规模、高质量的生态系统和其他适宜的美国和加拿大的生境的影响--以及这些让狼成为真正的狼。鉴于很少有濒危物种的重新引入能够成功（Wolf等人，1996年；Fischer和Lindenmayer，2000年），黄石国家公园合作小组的工作是首次评估高度成功的重新引入的遗传后果。总的来说，它的发现对保护遗传学和濒危物种恢复领域是一个宝贵的贡献（vonHoldt等人，2008；vonHoldt等人，2010）。

从生命史到演化史

除了这些DNA样本和谱系的最初应用，黄石公园的狼对分子生物学和演化动力学的广泛的新兴课题做出了贡献，从与健身有关的特征的遗传基础到犬科动物的演化。这些狼的样本继续为科学服务。为了探索狼对环境变化的潜在生态和演化反应，Coulson等人（2011年）利用经典的种群遗传学和数学模型，这些模型使用了关于个体性状（如毛色和体型）如何影响生存、生长和繁殖等生命率的信息。这项研究不仅为迷人的毛色故事做出了贡献（见本卷第8章），而且证明了先进的理论模型的应用，该模型以长期的狼群数据为参数，预测对环境变化的复杂生态和演化反应。

在深入探索过去的过程中，研究人员利用以一些黄石国家公园狼为代表的狼的基因组，获得了对我们北美犬科动物复杂历史的洞察力。演化研究的一个核心目标是揭开密切相关物种群体的复杂历史，而犬科被证明是最具挑战性的一个。当许多保护工作致力于了解濒危犬科动物（如红狼）的独特遗传历史时，来自黄石公园狼的数据已经成为一个可靠的参考。它们为科学家提供了一个经过验证的灰狼基因组，可用于评估犬科动物的祖先和独特的演化关系。vonHoldt及其同事（2011年）使用类似于流行的商业邮购祖先测试的方法，使用分布在基因组上的SNPs来创建北美犬科的第一个祖先分析。他们发现，通过使用西部郊狼和黄石狼作为祖先参考，北美犬类已经进行了几百代的基因交换，代表了一个独特的物种复合体。最近，黄石狼提供了完整的基因组序列，帮助科学家发现，虽然灰狼和郊狼代表了长期分化的北美血统，但东加拿大狼（Canis lycaon）和红狼（Canis rufus）代表了这两个物种的独特混合物（vonHoldt等人，2016）。

我们自己的物种与犬科动物有着复杂的进化史。灰狼是我们最亲密的动物伙伴--家犬的近亲（例如，Vilà等人，1999）。自从大约4万年前从灰狼驯化而来（Freedman等人，2014年），人类通过人工选择和严格的繁殖计划极大地改变了这种犬科动物的表型。黄石狼的基因组序列在对其历史的研究中起到了核心作用。在驯化野生狼的过程中，最吸引人和最复杂的变化之一是行为上的变化：家犬对人类的友好和交流行为与它的野生祖先狼的行为明显不同。这种行为上的差异促使科学家们假设，有一些重要的遗传成分塑造了犬类的个性，这可能有助于将野狼驯化为驯服的狗的过程。最近的研究发现，犬科动物基因组的一个区域的变化与狗和狼的人类指导的社会行为有关（vonHoldt等人，2017）。有趣的是，在这一基因组区域的人类对应物中，以及在与人类先天性疾病 “威廉姆斯-伯伦综合征 "相关的可变性格中，都发现了与犬科动物对应物惊人的相似度，其特征是极度好客等超社会行为。这些突变并不是家犬所独有的；相反，它们在世界各地的各种灰狼种群中都能找到，包括黄石公园的狼。这些突变可能为了解家犬的复杂驯化历史提供了一个关键的视角，可能揭示了突变的古老起源，这些突变为人类提供了与超社会性但毫无戒心的狼交好的能力。随着演化时间的推移，这种基因遗产可能是创造人类最忠实和最旺盛的伙伴的一个关键因素。

黄石公园的狼谱系也被用来计算某些性状的遗传率水平，即个体的性状与父母的相同性状的相关程度。当一个个体的性状与其父母的性状有很大差异时，就意味着环境的影响，而不是纯粹的遗传因素，对整个性状或表型的影响。然而，在实践中，要区分基因和环境对产生表型的影响是非常困难的。对野生种群遗传率的许多估计都依赖于兄弟姐妹之间的比较，众所周知，兄弟姐妹共享50%的基因。然而，兄弟姐妹往往也有许多共同的环境因素，事实证明，要区分两者是非常困难的。黄石公园的狼种群是独特的，不仅其谱系被广泛记录，而且正在进行的研究也广泛地量化了基因分型的狼的生态和社会条件，这可以被整合到遗传率的计算中，以更好地了解遗传和环境对性状的相对贡献。例如，利用正在进行的狼的攻击性行为研究的数据，我们利用谱系来估计个体在包间互动中会表现出的攻击性水平的遗传性（vonHoldt等人，2020）（图7.3）。我们的遗传性分析显示，仅仅考虑遗传学不足以解释这种复杂的行为特征。相反，我们发现，攻击性受到遗传学和养狼的社会和物理环境的错综复杂的影响。我们还可以应用这些研究策略来探索分子对一系列广泛的性状的影响，如疾病易感性、体型和社会地位。

狼的基因功能

人们普遍认为，遗传变异是适应环境挑战和生存的关键，如气候变化、疾病爆发、捕食者或猎物多样性的变化。对于跨代发生的变化来说，这可能是正确的，但个体一生中的适应机制涉及基因表达。每当我们吃饭、睡觉、运动或放松时，一组精选的基因就会被打开或关闭，就像一个分子开关；这种机制对日常生存至关重要，是对生活挑战（如纷争、饥饿或疾病）的一种回应。然而，我们在很大程度上对基因表达反应的规模及其在自然系统中的限制一无所知。尽管实验室的小鼠种群是在高度控制的环境中进行实验的理想选择，但研究结果往往只限于特定的情况和条件。越来越多的研究正在使用黄石国家公园狼的DNA，以及现在的RNA，以获得对野生自然种群中基因组功能的洞察。这两种类型的分子让我们了解到涉及控制基因表达的分子开关的两个不同过程。

来自黄石国家公园狼群的DNA已被用于研究DNA上发现的化学修饰，这些修饰调节着基因表达的时间和地点，被称为表观遗传学。这些修饰是表型或基因表达的可遗传变化，而不是由于DNA序列的变化。基因表达的表观遗传学调节对正常的细胞功能和发育很重要，因此对个人的健康也很重要（Jones 和 Takai 2001）。在人类中，这种调节功能的失调是许多疾病的特征，包括癌症（Jones和Laird 1999）。化学修饰的一种类型是在核苷酸胞嘧啶上添加一个小的甲基（CH3），这一过程称为甲基化。这种基团的加入就像一个开关，可以关闭局部基因的表达。然而，缺乏这些化学基团实质上是 "开 "的开关，导致基因的表达。随着基因组测序技术的新进展，现在可以对基因组进行测序，识别每个胞嘧啶，并确定它是否被甲基化。这种信息，超越了传统的遗传研究，现在可以告诉我们关于基因表达的当前和动态状态，以及个体狼是如何应对其环境的，从压力到营养到疾病和行为。在对社会性犬类进行的首次此类研究中，Janowitz Koch等人（2016年）调查了黄石国家公园35只纯种狼的甲基化状态，并估计了这种模式的遗传性，这对野生动物来说是一个独特的机会。这项研究揭示了灰狼和家犬之间甲基化的深度保守差异，表明存在狼和狗的特定基因表达模式，可以告诉我们更多关于这些犬类如何进化出它们的差异。继续研究将探索与狼的成长、压力以及与周围世界的相互作用有关的甲基化变化。对犬科动物的表观遗传学研究，就像对人类的研究一样，将继续让我们了解生物体的基因是如何被控制的，个体的生活活动如何影响基因作用和健康，以及累积起来，是什么让个体变得独特。

第二类分子是RNA--通常包含制造蛋白质的指令的短暂分子。从2008年开始，探索狼的基因表达的努力涉及一个全新的收集方案（Oster等人，2011年）。在黄石公园活捉的狼的血液被抽到旨在收集RNA的样品管中，RNA反映了目前正在表达的基因。这些狼是第一批使用下一代RNA测序技术对其基因表达进行表征的野生脊椎动物之一。利用这些技术，我们调查了诸如性别、年龄、等级和疥癣感染等因素是否会导致不同的基因表达模式（Charruau等人，2016）。我们表明，在模式物种和人类中支配基因表达的因素，如性别和支配等级，对狼的基因表达没有强烈影响。这一发现可能反映了狼社会的高度合作和整合性，以及等级和年龄之间的相关性。我们也没有发现感染疥癣的狼和健康的狼有明显不同的表达模式。然而，有一些证据表明，与疥癣有关的5个基因可能在其宿主中唤起免疫抑制特性。绝大多数情况下，狼的基因表达特征反而与年龄有关。狼的年老速度很快，因为大多数个体在6岁前就已经死亡，并且在这一时期显示出极度的伤害和疾病的证据。与这种衰老速度相匹配的是基因表达衰老的速度也同样快，因此，一只6岁的狼在基因表达方面经历了与老年人类一样多的变化，而且是在一个类似的基因子集上。这些结果显示，尽管狼和人类的生命史和环境存在巨大差异，但它们的衰老模式在演化上是保守的，如免疫系统和新陈代谢的恶化。这项工作不仅为在家犬中观察到的衰老和疾病模式提供了演化方面的洞察力，而且为今后在不断变化的环境中和以人类为主的景观中对狼的研究建立了关键的基线。此外，它还为其他野生脊椎动物的类似研究提供了一个新的先例和协议。

狼和基因组学的时代

我们已经进入了基因组学时代，目前的分子技术使科学家能够研究生物体内的整套遗传物质。狼一直处于野生物种基因组学工作的前沿，已经描述了旧世界狼的10多个基因组（Freedman等人，2014；Zhang等人，2014）。由于高通量DNA测序和计算机生成的生物信息学的力量，黄石国家公园的狼现在已经成为北美狼基因组的主要代表。事实证明，狼的基因组在定义狼的诊断性标记方面是非常有价值的，可以用来探测与家犬和郊狼的混杂情况（例如，vonHoldt等人，2013）。完整的基因组也可用于更准确地估计突变率--这一数值使科学家能够模拟有利和有害的变异如何在种群中积累（Marsden等人，2016），并更好地理解对各种性状的选择。

最近，我们已经完成了本章开头所描述的302M的基因组测序，以及他的六个狼群伙伴，包括他的配偶（569F）和她的后代。对于这些狼，我们有很高的测序分辨率（每个核苷酸大约覆盖25倍），以及它们之间已知的血统关系。有趣的是，这个血统的家族结构揭示了野外灰狼一胎多父的第一个确认案例。2006年，569F是德鲁伊峰狼群的一只从属繁殖雌狼，它产下的一窝狼包含了从属繁殖雄狼302M（子代570M）和优势繁殖雄狼480M（子代629M和694F）的基因型后代。

利用这些狼的基因组序列和血统关系，Koch等人（2019年）对野生狼的突变率进行了直接估计，这个数值是确定基因进化率和选择如何改变基因组的基本参数。除了小鼠的一项研究外，这项研究提供了灵长类动物以外的唯一直接的哺乳动物突变率。然后，这个突变率被用来估计犬科动物人口史上的一个关键事件的时间，具体来说，就是狗和欧亚狼的祖先种群之间的分歧时间，其时间在25000年到33000年前。

结论

遗传学研究的进展正在继续加强我们对生物学基本原理的理解。从生命演化史的综合模型的可能性到破译人类疾病和健康的遗传基础，遗传学进步的承诺是令人兴奋的，如果不是压倒性的。考虑到科学发现的渐进性，我们可以把具有丰富遗传研究历史的狼作为这一领域的重要贡献者（Wayne和Vilà，2003年；vonHoldt等人，2010年）。但是，除了为科学而科学之外，狼研究的贡献在保护方面也有重要的应用。人类活动的影响已经从根本上改变了世界各地的自然空间，而且在未来会更加严重。这种影响将不成比例地影响到大型食肉动物，因此为这些物种建立遗传基线，并开发预测工具，以校准和预测它们在未来的遗传反应，是至关重要的。涉及黄石公园狼的遗传研究在很大程度上是为了满足这一需求。我们已经利用各种遗传标记建立了狼的遗传基线。我们已经证明了遗传上健康的狼群的组成部分，我们也证明了种群之间的遗传交流对于防止未来的遗传痛苦的重要性。我们已经建立并继续发展了近400只狼的种群血统，并追溯到黄石种群的创始狼，为了解行为和生理特征的遗传基础奠定了基础。我们推进了对狼的毛色遗传基础的理解，并探究了其在生存能力和抗病能力方面的作用。我们设计了使用狼细胞培养物的技术（见本卷第8章），可用于探测任何遗传变异体的功能，这可能是未来理解适应性的一个关键工具。我们第一次有了北美狼基因组的详细图谱，可以测量影响表型和适应性的单个基因的突变率。我们现在了解了影响野生种群中基因表达和调节的基本因素，这些因素可以限制对未来环境中的压力源的反应。我们有计划扩大这项研究，并在解释遗传和表观遗传模式时整合疾病和行为数据。这些努力将继续使像302M及其后代这样的人处于基因组学研究的前沿，将我们对狼的理解，也许还有我们自己，提升到一个新的高度。

请访问黄石狼网站（press.uchica go.edu/sites/yellowstonewolves/），观看对丹尼尔-R-斯塔勒的采访。

K基因座：黑狼的崛起

我想，在这些狼身上表现出的一些变异性可能是由于在野外与狗的杂交而造成的。

阿道夫-穆里，《麦金利山的狼》（1944）。

在黄石国家公园的狼被消灭后不久，国家公园管理局的生物学家阿道夫-穆里（Adolf Murie 1940）就去了阿拉斯加。在这里，他受国家公园管理局的委托，对现在的德纳利国家公园和保护区内的狼和白大角羊之间的关系进行评估。穆里是一位开创性的生物学家，他的工作对终止国家公园内的捕食者控制行动至关重要，他实际上是一个敏锐的观察者。作为第一个在野外研究狼的科学家，他进行了详细的实地观察。在穆里的经典著作《麦金利山的狼》中，他描述了他所观察到的狼的毛色图案的巨大变化。他利用这些皮毛图案来帮助他的研究，他写道："许多狼的颜色或图案非常明显，从远处就可以辨认出来。我发现灰色的狼更容易识别，因为在它们中间，颜色图案的个体差异比黑狼要大"（Murie 1944, 25）。他在研究时不仅在麦金利山观察到黑狼和灰狼的数量相当，而且他推测这种变异的起源与该地区的狗杂交有关。

本章是关于狼的毛色变异的精彩故事。具体来说，它记录了发现黑狼的起源和在野外持续存在的冒险。这个故事不仅突出了黄石公园狼对科学的贡献，而且还揭示了精心策划的、长期的、跨学科的科学研究有时可以带来偶然的发现。从一开始，对黄石公园狼群的研究就涉及到一系列广泛的生物课题的数据收集。虽然这种长期研究有助于我们对大型食肉动物及其在生态系统中的作用的了解，但它也揭示了一个迷人的和意想不到的狼的遗产。鉴于现代狼学之父阿道夫-穆里对这一主题的早期思考，这个故事肯定会令他着迷。

不同颜色的狼

正如灰狼（Canis lupus)的俗名所暗示的那样，灰色是北美和欧亚大陆最大的野生犬类的典型色调。尽管灰狼可以表现出从煤黑到北极白的皮毛颜色，以及两者之间的色调变化，但它们在世界范围内最常见的是花纹灰。这些狼的腿部、腹部和胸部有浅色、白色的毛发，从前额到颈部、肩部和臀部有棕色和黑色的外层被毛，尾巴是黑色的，而不是单一的灰色。我们在一些狼身上看到的另类颜色，如银色、灰白色的曾经的黑狼或乳白色的个体（图8.1），可能涉及不同颜色基因的色素控制或因衰老而产生的衰老模式。北美的独特之处在于灰狼的黑色、黑化的频率很高，在许多种群中接近50%的个体，尤其是在北美大陆的西部（Dekker 1986；Gipson等人，2002；Musiani等人，2007；Anderson等人，2009；Hedrick等人，2014）。黑狼在五大湖区各州和加拿大东部不太常见(Mech and Frenzel 1971; Mech and Paul 2008; Hedrick et al. 2014)。最极端的是北极狼（C. l. arctos）的乳白色皮毛和西南墨西哥狼（C. l. baileyi）的灰色、黑色、铁锈色和淡黄色。在旧世界，黑狼在所有可靠的文献记载中都是罕见的。从19世纪开始，可以找到零星的历史报告，表明在西伯利亚、法国、瑞典和苏格兰有黑色的标本。更早的证据来自于对中亚一个考古遗址中发现的狼形态的骨头上的被毛颜色基因的古代DNA分析，时间是4000-5000年前（Ollivier等人，2013）。最近在印度（Lokhande和Bajaru 2013）和伊朗（Khosravi等人2015）也有黑狼存在的报道。撇开这些报道不谈，今天旧世界的黑狼主要限制在狗和狼杂交的地区，例如在意大利（Galaverni等人，2017）。

但是，对于数十万以黄石国家公园为中心与野生狼打交道的人来说，狼的调色板上有黑色和灰色的个体。事实上，在黄石公园，全部都是灰色个体的狼群是很罕见的。值得注意的例外是尼兹佩尔斯和天鹅湖狼群，它们的全灰色的繁殖对提供了毛色遗传的线索，我们将很快解释。我们首先可以把大黄石种群的创始者作为不同毛色的来源。在1995年和1996年之间，总共有25只灰狼和16只黑狼从加拿大和蒙大拿州西北部的来源种群中被重新引进。并非所有这些个体都成为繁殖者，并将他们的基因传递下去。但我们可以跟踪这些原始狼的后代22年的毛色变化，平均约50%为黑色，50%为灰色（图8.2A）。这种颜色频率的平衡甚至在狼重返黄石公园的第一个十年后就很明显，它是一个引人入胜的演化故事的另一条线索。

颜色基因及其功能

自然界中最引人注目的多态性状之一是动物的颜色。多种类型的色素及其空间分布决定了动物身体上的彩色毛发、皮肤、羽毛或鳞片的外观（Protas和Patel 2008）。颜色的变化可以起到多种功能，包括伪装、在物种之间或内部发出信号，以及温度调节（Protas和Patel 2008）。事实上，一些动物的色素，如深色的黑色素，与生理和行为特征有关，如攻击性、性行为或对压力和疾病的反应（Ducrest等人，2008）。在这种情况下，一个基于黑色素的着色基因可以影响可观察到的特征或表型的多个不相关方面，这种现象被称为多效性。因此，颜色基因的功能不是那么黑白分明的。控制颜色的基因对动物健康的影响比单纯的颜色更广泛。

哺乳动物中几乎所有颜色的变化都由两种色素类型控制。黑色和棕色的色素来自产生尤美兰的黑素细胞，而红色和黄色的色素来自产生真黑素的黑素细胞。皮肤或毛发中的黑素细胞产生的真黑素和类黑素的数量和类型主要由涉及两个基因（称为Agouti和Mc1r）的遗传途径调节（Protas和Patel 2008）。然而，在各种哺乳动物中，有许多基因可以参与着色。例如，在不同的家犬品种中看到的不同的颜色模式是由至少七个不同的基因造成的，包括Agouti和Mc1r（Schmutz和Berryere 2007）。随着时间的推移，基因突变的积累导致颜色基因的不同变体，称为等位基因，影响色素的数量和在细胞中的分布。动物中比较常见的皮毛颜色突变之一是黑变病，在这种情况下，个体在其身体上显示出深色的黑色素。Mc1r的突变是许多家畜和实验室动物物种以及自然界动物种群中公认的黑变病的原因（Robbins等人，1993）。

然而，最近发现一个替代基因，称为CBD103（或K位点），可导致家犬的黑色素沉淀（Candille等人，2007）。在狗身上，祖先的野生型CBD103等位基因允许正常的Agouti和Mc1r基因相互作用，而CBD103基因的三个核苷酸缺失会导致CBD103蛋白阻止Agouti功能，从而导致黑色毛发的显性遗传（Candille等人，2007；Kerns等人，2007；Anderson等人，2009）。鉴于这一发现，研究人员认为要研究家犬的野生祖先，以确定类似的基因变异是否会导致狼的黑毛色。的确，研究人员发现，K基因座的一个三核苷酸缺失变体会导致狼的黑色毛色（Anderson等人，2009）（图8.3A）。许多已知颜色的黄石狼被对K基因座进行了基因分型（评估遗传变异）以帮助这一发现（Anderson等人，2009）。

通过利用黄石狼血统的力量，从创始狼开始，加上个别狼的K位点基因型，我们能够研究颜色的遗传模式（Anderson等人，2009）。回顾我们提到的全灰的Swan Lake和Nez Perce狼群只有灰色的繁殖狼。相比之下，黄石公园的大多数狼群都有黑狼和灰狼，而且繁殖对往往是由一只黑狼和一只灰狼组成，它们生产的窝里既有黑狼也有灰狼幼崽。黄石公园狼的K位点基因型告诉我们，当狼从父母双方获得灰色等位基因时，就会出现灰色表型（即，当野生型等位基因ky纯合时）。然而，黑色表型发生在狼从父母其中一方接受黑色等位基因时（KB等位基因杂合），这是常见的，或从父母双方接受黑色等位基因时（KB等位基因纯合），这是罕见的。因此，Anderson等人（2009）发现KB等位基因对被毛颜色有显性影响，这意味着杂合和纯合KB等位基因的狼都有黑色被毛颜色，而纯合野生型ky等位基因的狼有灰色（agouti）被毛颜色（图8.3B）。因此，两只野生型灰色的狼只能产生灰色的ky纯合后代。

许多读者可能还记得他们早期的生物课，19世纪的奥地利僧侣孟德尔（Gregor Mendel）通过对豌豆植物进行实验，概念化地证明了生物性状的遗传规律（Henig 2001）。狼的黑毛色的遗产是孟德尔遗传模式的一个现代教科书的例子（见图8.3B）。更重要的是发现了影响特定表型的基因变异，这在研究自然种群时是很罕见的。识别特定基因突变的研究通常使用实验室培育的模式物种，这使得性状的遗传基础可以通过对后代的表型评估而被发现。狼是独特的，因为它们的亲戚--家犬，一直是广泛的遗传研究的焦点。因此，我们有一个关于狗的特征（如毛色）和狗的基因组所包含的遗传信息库，可以用来了解野生狼的表型变化。有了孟德尔或穆里等科学家所不具备的分子技术，我们也有能力透过过去的窗口，探索这种性状变异的演化史。

黑色毛发的一个不寻常的来源

在确定了K基因座的功能及其遗传方式后，我们又调查了黑毛色的来源。被驯化的动物往往受益于在其野生祖先中具有优势的基因突变，如影响体型和寿命的白细胞介素1生长因子（IGF1）基因（Gray等人，2010）。然而，遗传数据支持狼的K基因座的情况正好相反，因为人们发现KB等位基因产生于家犬，并通过杂交转移到狼身上。狗是在15000多年前从狼驯化而来（MacHugh等人，2017），而K位点是家犬的基因引入野生狼的第一个证据（Anderson等人，2009）。安德森等人（2009年）使用52个SNP（单核苷酸多态性）的遗传标记数据集，对从黄石公园到育空地区以及向东的47只狼进行研究，发现K位点在黑狼中经历了非常强烈的正向选择（选择性清除）。当一个基因突变进入一个种群并赋予拥有该变体的个体一些优势时，就会发生选择性扫荡，该变体在种群中的频率会迅速增加，以至于没有足够的时间让该变体基因发生新的DNA突变，或让重组打破它周围的DNA。因此，含有该突变的基因单倍型（作为一个单位遗传的染色体区域）被说成是 "扫荡 "到一个高频率，在含有该突变的单倍型上留下了低遗传变异的特征签名。在狼群中发现了这样的特征，表明在最初从狗引进的事件后发生了强烈的选择。换句话说，该突变是通过杂交转移到狼身上的，然后接受该突变的狼的后代比它们的同类有一些健康优势，并产生了自己的带有该突变的后代。

有什么证据表明颜色突变是由家犬纳入狼的基因库，而不是反过来？来自染色体K位点区域的遗传数据可以用来确定个体的相似性，使用的方法称为演化树构建邻接法。来自狗和狼的这些数据的邻接树根据分类群（狼或狗）将野生型的灰色ky单倍型分组，但将黑色KB单倍型分组，而不考虑分类群。这种模式表明，该突变有一个单一的起源，随后通过杂交进行传播。为了确定杂交的方向，Anderson等人（2009）估计了KB和ky等位基因在狗和狼中的年龄；他们发现KB等位基因在狼中比在狗中年轻得多。这一发现表明，该基因的引入是由狗到狼发生的，并且该变体从杂交点传播，横扫整个北美狼种群（Schweizer等人，2018）。

黑色毛发的地理起源

自最初发现K基因座以来，大量的工作已经阐明了该基因的演化历史和生态重要性。在一项研究中，Schweizer等人（2018年）使用捕获测序（一种对基因组数千个区域进行测序的方法）对黄石公园的200多只狼以及北美其他种群的狼的K基因座进行测序。这种方法允许测量和比较不同种群之间的遗传变异水平。根据亲缘关系的遗传措施，他们估计狼和狗之间的引入事件发生在北美西北部的某个地方。加拿大育空地区和西北地区的狼种群具有非常高的KB单倍型的遗传多样性，这表明这些种群可能在引入后的最长时间内具有KB等位基因。耐人寻味的是，本地狗和人类在这个地区有很长的共存历史。

一些探索美国本土犬种地理起源的研究表明，北极犬种，如因纽特雪橇犬、加拿大爱斯基摩犬和格陵兰犬，具有古老的线粒体DNA单倍型，并显示出与狼的古老混杂证据（Brown等人，2013；van Asch等人，2013）。此外，这些种群中的狗代表了唯一具有新世界狼特有的线粒体单倍型的现存品系，而这些品种的黑色被毛颜色是由K基因座的突变决定的。基于这些发现，我们推测最初的引入事件发生在北美的西北部地区，在那里狗和原住民首先与共享类似猎物（如驯鹿）的狼种群共存。值得注意的是，与狼的KB单倍型最接近的狗品种，拉布拉多猎犬，是在北美的高纬度地区发展起来的，可能与北美本地的狗有共同祖先，这些狗与第一批与狼成功杂交的黑狗有关（Schweizer等人，2018）。

在最初对北美狼的K位点进行的研究中，估计从狗到狼的引入事件发生在大约13000年前（Anderson等人，2009）（图8.4）。然而，该估计所使用的数据是基于在狗和狼身上的52个SNPs的基因型。广泛的全基因组重测序提供了更高的遗传变异分辨率，结合估计等位基因年龄的新方法，使引入事件发生的时间更晚。最古老的KB等位基因年龄值出现在育空狼身上，其平均值从1598年到7248年前不等，取决于所使用的突变率（Schweizer等人，2018）。最年轻的等位基因年龄出现在黄石狼种群中，从202年到1942年前不等；这个估计的时间反映了黄石狼创始狼的影响，它们的祖先可能是最近才获得遗传突变的。

对K基因座的选择

在阐明了北美狼黑色素的演化史后，我们又问，为什么黑色的毛色对狼来说可能是有利的？当K基因座周围的遗传模式显示出对黑色突变的强烈选择时，这个问题就很有意义了。此外，如果黑色被毛的颜色似乎受到强烈的选择，那么为什么黑色和灰色被毛的颜色在一些北美种群中仍在分离？黑狼和灰狼之间的健康权衡是否能解释这些种群中两种颜色随着时间的推移而保持下来？这些问题为探讨遗传学、生存能力、健康和选择之间的联系的研究奠定了基础（例如，Coulson等人，2011；Stahler等人，2013；Hedrick等人，2014；Schweizer等人，2018）。鉴于其相对于K位点的遗传学、行为学、生命史和种群学的长期和详细数据，黄石狼是这个舞台上的明星选手。

其中第一项研究采用了经典的种群遗传学与复杂的数学建模方法相结合，将生存和繁殖成功数据与K位点基因型结合起来，对280只狼进行了11年的研究（Coulson等人，2011）。从这些数据中，估计了K位点基因型的具体种群统计率和生命史参数。这些估计值可以比较KB等位基因纯合和杂合的狼（均为黑色）与野生型k y等位基因纯合的狼（灰色）之间与健康体质有关的生命率（如年生存率、寿命和繁殖成功率）。这项研究表明，杂合的黑狼具有最高的达尔文适合度，具有最大的生存率和繁殖成功率，其次是纯合的灰色个体，其可比性略低。有趣的是，KB等位基因纯合的黑狼生存率和繁殖率非常低，这在一定程度上解释了它们在种群中的频率低于预期。在黄石公园捕获的狼中，只有5%的狼是黑色纯合基因。相同毛色的个体之间在体能上的这种显著差异是一个关键的发现。首先，它有助于否定黑色被毛颜色被选为适应性伪装的观点--例如，它通过在更多的森林环境中掩盖狼的身影而在捕猎中赋予某种优势。由于黑色的同种异体的存活率和繁殖成功率都很低，而且在调查的种群中非常罕见，因此很明显，黑色被毛本身并没有带来选择优势。那些熟悉狼的人认为，狼是很少隐藏或伏击猎物的捕食者，当适应性伪装假说首次被提出时，他们已经对其持怀疑态度（Anderson等人，2009）。

更重要的是，这些结果表明，K位点基因型之间不同的存活率和加入率使黑色等位基因具有杂合优势。杂合优势意味着杂合基因型比纯合显性基因型或纯合隐性基因型具有更高的相对适应性（Fisher 1922；Hedrick 2012）。一个公认的杂合优势的案例是人类的等位基因，它在纯合个体中引起镰刀型细胞贫血，但却使杂合子个体对疟疾感染有更强的抵抗力，在疟疾肆虐的地区最为常见（Hedrick 2011）。考虑到1995年和1996年创始狼种群中基因型的原始分布，对预期的K位点等位基因频率进行建模的分析（Hedrick等人，2014），以及通过独立确认（Schweizer等人，2018），进一步支持了狼体内黑色等位基因的杂合优势。这项工作在一定程度上解释了黄石种群中观察到的黑色KB和灰色ky等位基因的频率是由平衡多态性造成的，这种情况下，杂合子具有最高的适宜水平，导致两种表型的维持。但问题仍然存在。会不会有其他因素影响种群中两种毛色的维持？黑色等位基因的选择优势又是什么？Coulson等人（2011年）和Hedrick等人（2014年）都推测，强烈的黑色杂合优势的存在，以及黑色和灰色纯合在体质上的巨大不对称性，表明该基因的某些其他功能可能决定了体质差异。基于这项工作，我们推测K基因座可能对抗病性或其他与免疫学有关的性状具有多效性。这是因为K基因座除了在犬科动物的黑色中起作用外，还是一个β-防御素基因，属于哺乳动物的一组基因，与抵抗某些类型的微生物病原体有关。但在我们阐述该基因的这一特性之前，另一个涉及被毛颜色的迷人发现使我们了解到黑狼和灰狼是如何在黄石国家公园保持相似的频率的。

异性相吸

对于人类和所有其他动物来说，生命是关于选择的。对动物来说，一个重要的决定是选择一个能产生后代的配偶。因此，各种分类群中的非随机配偶选择模式长期以来一直引起各学科科学家的兴趣，包括动物行为、物种划分和一般的演化（Lewontin等，1968；Partridge，1983；Coyne和Orr，2004）。根据与自己的相似性（即相似的表型）选择配偶，被称为正选型交配，代表了自然界中个体的总体倾向（Jiang等人，2013）。可证实的动物与表型不相似的个体交配的例子很少。然而，这种负选型交配（或异型交配）可以减少近亲繁殖（Pusey和Wolf 1996），增加和维持遗传变异（Jiang等人，2013；Hedrick等人，2016）。

多年来对黄石公园每个狼群的繁殖对的详细了解，提供了一个独特的研究机会。狼是否会根据毛色来选择配偶，这种配偶选择是否可以为黑色杂合子的频率提供另一种解释？为了回答这个问题，Hedrick等人（2016）使用了21年的黄石公园狼交配事件的数据，发现不同颜色的狼之间有大量的配对（图8.2B）。事实上，64%的配对是在灰狼和黑狼之间进行的（N = 261，1995-2015），而且灰公狼×黑母狼和黑公狼×灰母狼的交配也同样过多。之前的工作已经证明，狼会选择非其近亲的配偶（vonHoldt等人，2008年），但这项新的分析证明了另一种形式的非随机配偶选择与毛色有关。令人惊讶的是，灰狼和黑狼之间的交配似乎是哺乳动物中唯一有记载的任何性状的负选型交配的例子，也是脊椎动物中唯一有记载的单基因、自然发生的颜色多态性的例子（Jiang等人，2013；Hedrick等人，2016）。

这一发现对过去22年黄石公园黑狼和灰狼频率稳定的总体模式具有重要意义。尽管Coulson等人（2011）和Hedrick等人（2014）的工作表明，黑色等位基因的杂合优势可以解释观察到的平衡颜色多态性，但现在出现了一个 "异性相吸 "的案例。Hedrick等人（2016）在随机或负选型交配的模型中使用观察到的交配频率，发现负选型交配情况下黑色KB等位基因的预测频率与观察到的平均值接近。这一结果意味着KB等位基因的观察频率，项比随机交配事件，负选型交配可以更好地解释。此外，基因型频率的模式--即观察到的黑色纯合基因的比例和观察到的黑色杂合子的过剩--与负选型交配相一致。重要的是，这些结果表明，负选型交配可能是维持黄石公园狼种群颜色多态性的全部原因（Hedrick等人，2016）。尽管这些发现有助于解释在黄石公园观察到的一些毛色频率模式，但它们不一定排除杂合优势的作用。此外，这些发现都没有为黑色KB等位基因的负选型交配或杂合优势的机制提供直接证据。

被毛颜色对繁殖和行为的影响

近年来，又有两项发现将黄石狼的毛色与行为和生命史特征联系起来。在一项关于雌性繁殖成功率的研究中，我们确定了决定产仔数和产仔存活率的各种因素的优势（Stahler等人，2013）（见本卷第3章和第4章）。除了更可预测的雌性年龄和体型、群体大小、疾病和种群密度对繁殖性能的影响外，Stahler等人（2013）发现，灰色毛发的雌性比黑色雌性的年产仔存活率高25%。他们假设，繁殖和其他健康因素（如生存）之间的权衡可能解释了黑色和灰色雌性生殖成功的这些差异。鉴于基于黑色素的着色通常与野生脊椎动物的能量平衡、压力和免疫力的调节作用有关（Ducrest等人，2008；Gasparini等人，2009），KB等位基因与免疫能力之间可能存在正相关，使黑色杂合狼具有生存优势。然而，免疫的成本可能会导致黑狼的能量消耗，转移原本有利于其繁殖成功的资源（例如，通过妊娠和哺乳），这种模式已经在其他哺乳动物（Graham等人，2010）和鸟类（Gasparini等人，2009）中得到证实。

另一项研究发现，被毛颜色在领地行为中起作用，在与其他狼群相遇时，黑狼的攻击性比灰狼低。Cassidy等人（2017）在一项为期16年的研究中记录了狼群间相遇时的攻击性行为，发现当两个狼群规模相同时，灰色个体比黑色个体驱赶敌对狼群的可能性高近1.5倍。这一发现耐人寻味，因为对黑色动物的其他研究发现，在一些物种中，深色个体比浅色个体更具攻击性（Ducrest等人，2008）。然而，在狼群中，这种模式可能与个体对应激情况的不同反应有关，并且K位点可能对应激的生理反应有次要影响。Cassidy等人（2017年）比较了黑狼和灰狼的皮质醇水平，这是一种对应激反应释放的激素。他们发现，灰狼的皮质醇基础水平比黑狼高。同样，黑色家犬的基础皮质醇水平（Ben-nett和Hayssen，2010年）和攻击率（Houpt和Willis，2001年；Amat等人，2009年）也比非黑狗低。回顾一下，基于黑色素的着色基因通过对黑色皮质素系统的多效作用与生理和行为特征（如免疫系统功能、应激反应）相关（Ducrest等，2008）。我们的结果表明，K位点可能与激素分泌有错综复杂的联系，因此，可能影响攻击性行为。此外，皮质醇的产生可以削弱免疫系统的功能，这可能与一个功能假设有关，即灰色狼的免疫系统功能与黑狼不同。这给我们带来了迄今为止对K基因座选择机制的一个更具体的解释：它与增加对疾病或其他免疫学相关性状的适应力有关。

K位点在免疫中的作用

自从最初发现K位点蛋白（CBD103）是β-防御素家族抗菌肽的成员（Pazgier等人，2006）后，人们猜测它可能参与适应性免疫反应（Yang等人，1999）。防御素由几乎所有脊椎动物的皮肤、肾脏和气管支气管内壁的上皮细胞产生，它们在微生物入侵时可以释放防御素（Yang等人，1999）。这些多肽通过增加目标膜的通透性，从而抑制微生物内的DNA和RNA活动，引发对细菌、病毒和真菌的抗菌反应（Ganz 2003）。在狗身上，编码防御素的基因在基因组中成簇出现，包括16号染色体上的几个基因，K基因座就出现在那里。这些基因在不同的品种中出现不同数量的拷贝（Leonard等人，2012），尽管目前还不清楚更多的拷贝是否对应于更高的抗菌反应。K基因座在皮肤（Candille等人，2007年）和上呼吸道（Erles和Brownlie，2010年）中高度表达，并在对狗的呼吸道病原体--支气管败血波氏杆菌的反应中显示出抗菌活性（Erles和Brownlie，2010）。作为黑皮质素途径的一个确定的组成部分，K位点除了影响生理和行为特征外，还可能抵御病原体（Ducrest等人，2008）。

这一难题中最难以捉摸的部分是K位点对狼的健康影响的确凿证据。对黄石国家公园传染病作用的研究提供了研究表型或基因型特定的毛色与疾病之间是否存在联系的机会。在已知影响黄石公园狼的各种传染病中，犬瘟热病毒（CDV）和疥癣（由寄生性疥螨引起）是值得注意的角色（Almberg等人，2009，2012）。关于疥癣，我们还没有发现黑狼和灰狼之间在感染率、严重程度或恢复方面有明显的差异，也没有发现K位点基因型之间的差异。这有点令人惊讶，因为已知β-防御素在皮肤上皮细胞中具有抗菌特性，而皮肤上皮细胞是螨虫成功入侵其宿主的环境。关于CDV，一种影响狼的呼吸道、胃肠道、结膜（眼睛）和中枢神经系统的病毒病原体，我们确实发现了一种颜色基因型的特定模式。初步的数据分析表明，黑色杂合狼在疾病爆发年（1999年、2005年、2008年）暴露于CDV后，其年存活率可能高于灰色纯合狼。尽管到目前为止，被毛颜色和疾病之间缺乏可验证的联系，但我们继续用在黄石公园收集的数据探究可测试的假说。

在本卷第七章中，我们说黄石公园的狼一直处于基因组研究的前沿。可能没有比将尖端的细胞系研究应用于K位点难题更好的例子了。最近，我们开发了细胞培养技术，使狼的成纤维细胞（下层皮肤的细胞）和角质细胞（上层皮肤的细胞）的细胞系可以从狼捕获期间的耳部活检针头中发展出来（Johnston 2016）（图8.5）。这些细胞系的转化提供了一个无限的DNA和RNA来源，并给我们提供了一个非侵入性的方法来测试特定细胞层面的挑战对基因的影响。有史以来第一次为野生动物建立了基于种群的细胞检测。这一成功是第一个实验步骤，使我们能够测试灰色和黑色K位点基因型是否会对病原体暴露作出不同的反应。

具体来说，这些细胞培养技术被用来评估K位点在表皮组织中的等位基因特异性功能，该基因在表皮组织中高度表达（Johnston 2016）。角质细胞培养方法建立了一个来自野生狼的角质细胞系小组。然后，从黄石公园和爱达荷州的24只野生狼建立了细胞系，代表了14只纯合野生型ky灰狼和10只杂合型KB黑狼。不幸的是，鉴于纯合KB黑狼的罕见性，没有获得纯合KB基因型的皮肤活检。然而，这一问题通过使用最近的基因组编辑技术得到了解决，该技术正在科学和医学研究领域引起热议。这种独特的技术，称为CRISPR/Cas9，允许科学家通过移除、添加或改变DNA序列的部分来精确编辑个体基因组的部分（Zhang等人，2014年）。CRISPR/Cas9基因编辑被用于单个野生型ky灰狼细胞系，以构建黑KB等位基因杂合和纯合的细胞系（Johnston 2016）。

为了评估每个细胞系对微生物感染的细胞反应，我们用合成抗原以及活体CDV感染了角质细胞。尽管角质细胞对这些免疫挑战表现出基因表达反应，但它们在K位点基因型之间并没有表现出明显的表达差异。这一发现表明，K基因座对病原体暴露反应的潜在影响不是由对角质细胞内基因调控的影响所介导的。然而，K基因座可能影响免疫的其他机制仍未得到验证。首先，在细菌或病毒与β-防御素肽的直接相互作用过程中（Wilson等人，2013年），KB等位基因可能会降低肽与细菌或病毒的结合亲和力，最终导致进入细胞的可生长发育的细菌或病毒数量减少。此外，β-防御素的抗菌活性可能只在活的、会呼吸的狼的实际皮肤、口腔或呼吸环境中体现出来，而不是在培养皿中生长的细胞系中。最后，KB等位基因对体质的影响可能是由本研究中未评估的对病原体的反应所介导。尽管最初的实验研究没有发现KB等位基因的免疫学优势，但这是一个重要的科学进步。除了测试关于K基因座的假设外，细胞系的构建可用于探测野生环境中任何基因变体的功能，并可能成为未来研究中理解适应性和健康性的关键工具。

目前，K基因座的具体选择重点仍不确定。但我们知道，除了导致黑色素沉着外，这个基因还具有免疫功能。鉴于一个物种内以黑色素为基础的颜色变化往往与生理、行为和生命史特征的变化有关（Ducrest等，2008），通过基因型与环境的相互作用，可供选择的颜色形态可能在不同的环境中受到青睐（Roulin 2004）。在鸟类和鱼类中，不同颜色的个体对压力、食物供应和疾病有不同的反应（Kittilsen等人，2009；Almasi等人，2010；Jacquin等人，2013）。在多变的气候和环境条件下，这种反应的变化可以促进颜色多态性的维持（Karell等人，2011；Jacquin等人，2013）。因此，类似的过程可能发生在历史上狼所面临的不断变化的环境中，增强了K基因座的选择。可以想象，KB等位基因可能首先在狗身上演化并持续存在，因为它对在旧世界密集的狗群中兴起的疾病具有更强的免疫力。这可能使该位点预先适应了邻近的狼种群的选择，这些狼种群在早期人类和狗殖民北美时也可能被基于狗的新疾病感染。与这种猜测一致，Schweizer等人（2018年）在黄石狼种群中检测到了近期K位点平衡选择的特征，该种群遭受到与生态系统中其他食肉动物物种共享的复发性传染病。这些狼可能代表了在高食肉动物密度下对K基因座进行自然选择的当代案例，这些食肉动物密度是病原体的储库，黑色等位基因提供了更强的免疫力。

建立一个关于毛色选择的综合模型

最近，尚未发表的建模工作试图将狼的毛色叙述的各条线联系在一起。Sarah Cubaynes及其同事将Coulson等人（2011年）、Stahler等人（2013年）和Hedrick等人（2016年）的研究结果纳入一个单一的模型，其中包括杂合子的生存优势、灰狼的繁殖成功优势和负选型交配。然后，他们用这个模型研究了如果改变黑色杂合子生存优势的强度、灰色生殖成功优势的强度、交配系统和疾病频率会发生什么。

该模型显示，随着疾病爆发频率的增加，应该有更多的黑狼和更多的黑色等位基因的频率。即使灰色繁殖优势和黑色杂合子优势的相对强度被修改到20%，也能预测到这一结果。此外，该模型预测，当疾病爆发每六年或更长时间发生一次时，那些负选型交配的狼应该比那些正选型交配的狼有更高的健康能力。

结论

科学进步的最大特点是知识的递增。突破和创新也说明了具有不同专业领域的科学家之间的合作的价值。

具有不同专业领域的科学家之间的合作价值。北美黑狼的崛起、K位点基因的功能及其演化史的史诗故事就是这一过程的缩影。通过将我们强大的研究镜头对准黄石公园的狼，我们不仅了解了黑毛色的遗产，而且还发现了其重要的种群学、行为学和生态学意义。此外，尽管它与免疫力的联系需要进一步解决，但在未来狼将面临的不断变化的环境条件下，包括疾病、气候变化和栖息地退化，毛色可能会变得更加重要。

在这条发现的道路上，K基因座的故事已经成为一个重要的科学案例。例如，它证明了在驯化过程中出现的变异体在野外也是可行的，并能丰富自然种群的遗传遗产。换句话说，杂交可以是适应性的。此外，我们确定毛色变异的遗传结构的能力，有助于我们确定自然界中遗传变异的选择和维持机制。这个故事揭示了社会食肉动物在繁殖、生存、健康、攻击和配偶选择方面的健康影响和权衡。即使是狼的KB和ky等位基因的孟德尔遗传模式，也为生物教育者和学生提供了一个引人入胜的课程，否则他们就会面临思考一个由19世纪的科学家进行的古老的豌豆植物实验。我们的研究还证明了将前沿技术应用于野生动物的可行性，如基因组捕获阵列、种群级细胞系和先进的基因编辑工具。最后，它强调了深思熟虑、以问题为导向的长期研究的价值。

北美黑狼的遗产可能始于泰加林区的某个地方，当时一只野生灰狼与一只与早期原住民队伍中的黑狗发生了一段情缘。从这里，我们可以追溯到几千年历史中的基因之旅，以及黄石国家公园的狼群。对于那些关注狼研究的丰富历史，甚至更广泛地关注分子遗传学和演化的人来说，K基因座的故事确实是一场发现的冒险。在阿道夫-穆里在黄石公园工作并北上观察阿拉斯加的黑狼和灰狼之前，黄石公园的一位管理员对狼进行了一次引人注目的观察（诺里斯1881，42）。在黄石国家公园1880年的年度报告中，该公园的第二任园长Philetus W. Norris写道：

大型、凶猛的灰狼或布法罗狼，鬼鬼祟祟、咆哮的郊狼，以及一种明显介于两者之间的黑褐色或黑色的物种，曾经在公园的所有区域都非常多，但它们的皮毛价值和它们很容易去捡食有马钱子碱毒物的兽尸，几乎导致它们灭绝。

直到最近，历史学家和分类学家都可能想知道如何理解诺里斯先生在1880年的历史引文。他将什么动物描述为具有 “黑褐色或黑色"？现在我们可能知道：它们是携带K基因座显性黑色等位基因的本地狼。

访问黄石狼网站（press.uchica go.edu/sites/yellowstonewolves/），观看Daniel R. Stahler的访谈

Part2未完... 

下接：