细胞系列【1】PBMC细胞的解读

牛顿光学

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       PBMC细胞是免疫系统的关键组成部分,因此在免疫学、传染病、恶性肿瘤、疫苗研发、移植治疗、个性化医学和毒理学等领域作为最基础的实验原料被广泛使用。

一、PBMC的作用

       PBMC（peripheral blood mononuclear cell），外周血单个核细胞，顾名思义，其主要细胞类型为血液里边具有单个核的细胞，主要包括淋巴细胞(T细胞、B细胞和NK细胞)，单核细胞，吞噬细胞，树突状细胞和其他少量细胞类型。其中淋巴细胞占很大一部分。(T细胞、B细胞和NK细胞)如图所示。

       这些细胞是先天免疫和适应性免疫系统的关键组成部分, 可以保护身体免受病毒、细菌和寄生虫的感染和异物侵扰, 并且能够消灭肿瘤细胞。

二、PBMC的分离原理

       分离PBMC的主要目的是为了将多核细胞和红细胞去除，从而更方便地对外周血中的单核细胞进行研究。分离单核细胞常使用Ficoll作为分离液的主要成分，它（Ficoll）是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400000，当密度为1.2g/ml时也未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分离液比重，离心后漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。吸取分离液液面上的细胞，就可从外周血中分离到单核细胞，并进行之后的培养与检测。

三、PBMC的培养

工具/原料

1）全血 （以10ml为例）

2）无菌PBS溶液(pH7.4) 或者生理盐水

3）蔗糖溶液（Ficoll Pague PLUS) (GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02)

4）RPMI 1640培养基 （Invitrogen）

5）胎牛血清（FBS）（GIBCO）

6）双抗P/S （Penicillin/ Streptomycin) (GIBCO)

7）二甲亚砜（DMSO）（SIGMA）

8）预先装好异丙醇的冻存盒

配制所需的溶液：
a. 细胞培养基：RPMI 1640+10% FBS+1% P/S；
b. 细胞冻存液：FBS中加入10%DMSO

方法/步骤

1； 将10ml全血转入50ml离心管中，加入10ml PBS溶液稀释，轻轻混匀；

2；取两支15ml离心管，先加入5ml Ficoll溶液。然后将稀释的血液轻轻加到两支离心管的ficoll上层，一定要轻柔，避免两种溶液混合在一起，每只离心管各10ml稀释血液；

3；2000rpm，20分钟，注意，降速设置中一定要设置成no break，或者只有1-2成的制动。离心完毕将得到如图所示分层：

4；PBMC所在细胞层为白色。此时可以用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15ml离心管中。

5；加入PBS至10-15ml，1,500rpm，10min离心后去掉上清，再加入培养基进行相同操作的清洗；

6；加入5-10ml培养基重悬细胞，进行后续计数培养或者铺板；

7；细胞冻存：将细胞离心收集之后，用细胞冻存液重悬。取1-1.5ml细胞至冻存管中，放入冻存盒（冻存盒可事先在4℃冰箱预冷）。再将冻存盒放置于-80℃冰箱过夜。第二天将细胞转入液氮中长期保存。

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       PBMC直径约为5-8μm，人工计数难度大，且计数结果偏差大，因此，能准确计数PBMC的细胞计数仪是实验人员的迫切需求。CytoEasy具有优秀的光路系统和图像识别系统，它不但可以准确计数普通细胞系，也能准确计数这类直径很小的免疫细胞。如下图所示：

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