Usp7通过去泛素化转录辅助因子Yorkie调控Hippo途径
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今天推荐的是由山东农业大学生命科学学院在2016年3月7日发表于Nature Communications（IF：12.117，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Zizhang Zhou教授，研究表明Usp7通过去泛素化转录辅助因子Yorkie调控Hippo途径。
研究背景
Hippo途径在器官发育和成人组织平衡中起着重要作用，它的失调已被牵涉到许多癌症中。Hippo信号传导依赖于一个核心激酶级联，最终导致转录辅助因子Yorkie（Yki）的磷酸化。尽管Yki是Hippo途径的关键效应物，但其蛋白稳定性的调节仍不清楚。
摘要部分
在这里，作者表明Hippo途径减弱了泛素特异性蛋白酶Usp7与Yki的结合，Usp7通过去泛素化Yki来调节Hippo信号传导。此外，Usp7的哺乳动物同源物HAUSP在通过调节Yap泛素化和降解来调节Hippo途径方面发挥了保守的作用。最后，作者发现HAUSP的表达与Yap的表达呈正相关，两者在临床肝细胞癌（HCC）标本中都显示出上调的水平。总之，作者的发现表明Yki/Yap被Usp7/HAUSP稳定，并提供HAUSP作为HCC的潜在治疗目标。
研究内容
1.Usp7促进Hpo目标基因的表达
为了探索调节Hpo-Yki途径的DUB，作者进行了RNA干扰（RNAi）介导的筛选。作者发现usp7在翼成虫盘和眼成虫盘中均匀表达，且Usp7蛋白主要定位在细胞核中。为了研究Usp7是否调节Hpo途径，作者在翼成虫盘中沉默了usp7，并检查了Hpo途径靶基因的表达。敲除usp7显然降低了diap1-lacZ的表达。此外，作者还检查了其他靶基因。与对照组相比，usp7的敲除削弱了CycE和ban-lacZ的表达。总的来说，这些结果表明，Usp7参与了Hpo-Yki信号的调节。
为了避免RNAi的脱靶效应，作者使用usp7的空等位基因usp7KG06814进行进一步实验。usp7KG06814克隆，以绿色荧光蛋白（GFP）信号消失为标志，在翼成虫盘中显示出果蝇细胞凋亡抑制因子1（DIAP1）和ban-lacZ染色的减少。作者还发现，在眼成虫盘的usp7KG06814克隆中，CycE蛋白减少。此外，usp7的异位过量表达大大增加了diap1-lacZ、CycE和ban-lacZ的水平。
有趣的是，作者发现usp7KG06814突变体克隆的面积比相邻的双胞胎斑点小，表明usp7的丢失可能阻碍了组织的生长。为了验证这一结果，作者产生了一些大的usp7KG06814克隆，并分析了克隆/孪生斑的面积比。与对照组克隆相比，usp7KG06814克隆在翼成虫盘和眼成虫盘中都表现出明显的生长缺陷。
研究结论：Usp7是Hpo-Yki信号转导的一个构成性的调节器。
2.Usp7作用于Wts的下游，Yki的上游
Hpo途径被定义为一个激酶级联，Hpo磷酸化并激活Wts，反过来，Wts磷酸化并灭活转录辅助因子Yki以抑制靶基因表达。作者接下来想探究Usp7是否与Hpo信号传导的关系。敲除Hpo增加了CycE蛋白水平，这被usp7 RNAi所逆转，表明Usp7位于Hpo的下游，控制Hpo途径。与Hpo类似，由wts RNAi引起的CycE和diap1-lacZ的升高被usp7敲除所抑制。由于Usp7在Hpo和Wts的下游调节Hpo信号，所以作者进一步测试Yki和Usp7之间的关系。敲除Yki后，diap1-lacZ的表达量减少，而usp7的过表达未能使其恢复。另一方面，由yki过表达诱导的CycE的上调不能通过沉默usp7而得到缓解。同时，敲除usp7会减少Yki蛋白。不仅如此，usp7的丢失也下调了Yki的水平，但不影响Yki的转录。
研究结论：Usp7在Hpo和Wts的下游、Yki的上游调节Hpo途径。
3.Usp7与Yki相互作用
鉴于去泛素化酶总是通过结合和去泛素化底物来发挥其作用，作者推测与Hpo途径的一个组成部分的相互作用对Usp7控制Hpo信号传导至关重要。为了测试这种可能性，作者在S2细胞中进行了共同免疫沉淀（co-IP）实验。与上述表观分析一致，作者发现Usp7与Yki相互结合，但不与其他Hpo途径成分结合，表明Usp7可能通过直接靶向Yki调节Hpo途径。Hpo途径中的大多数调节事件是由WW域-PPxY相互作用介导的，在Usp7蛋白中的搜索发现了一个PPxY降解子（121PPV124Y）正好位于MATH结构域中。为了测试Yki是否通过WWdomain-PPVY相互作用与Usp7结合，作者产生了Usp7-ΔMATH截断的构建体，并进行了联合IP实验。实验结果显示，Usp7和Usp7-ΔMATH都能拉低Myc-Yki，表明Usp7是以独立于MATH的方式结合Yki。
另一方面，作者通过co-IP和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）下拉实验发现，Yki的N端而不是C端负责其与Usp7的相互作用。为了确定Usp7的哪个区域负责Yki的相互作用，作者产生了各种Usp7截短的突变体。共同IP的结果显示，Usp7通过其C-末端的片段与Yki-N结合。作者接下来测试了Hpo信号传导是否影响Usp7-Yki的相互作用。野生型Hpo极大地阻断了Usp7-Yki的结合，而Hpo的激酶死亡形式（Hpo-KD）则发挥了相反的作用。
研究结论：Usp7通过MATH结构域和WW结构域的独立方式与Yki结合。Hpo途径可能通过减弱Usp7-Yki的结合来减少Yki蛋白。
4.去泛素酶的活性对Usp7调节Hpo途径至关重要
为了研究Usp7去泛素酶活性对其调节Hpo途径的重要性，作者产生了一个Usp7的去泛素酶缺陷突变体，其Cys250被Ala取代（usp7-CA）。联合检测结果显示，Usp7的这一突变并不影响其与Yki的相互作用。usp7-CA的过量表达降低了diap1-lacZ、banlacZ和CycE的表达，表明Usp7-CA可能起到了显性负作用。此外，回补实验显示，usp7-CA未能恢复usp7敲除引起的ban-lacZ的减少。然而，usp7-ΔMATH可以回补usp7敲除下的ban-lacZ水平。由于Hpo途径的活性与眼睛的大小密切相关，作者转向检查Usp7是否在Hpo激活的背景下调节眼睛的大小。与对照组眼（GMRgal4>UAS-wts）相比，敲除usp7或过表达usp7-CA导致眼球变小，而usp7或usp7-ΔMATH过表达则增加了眼球大小。
研究结论：Usp7以脱泛素酶依赖的方式调节Hpo途径的活性。
5.Usp7对Yki进行去泛素化
目前，对Yki蛋白的稳态调控了解不多。为了解决这个问题，作者在S2细胞中进行了脉冲追逐实验，发现外源Myc-Yki蛋白和内源Yki蛋白都不稳定，主要是由于溶酶体介导的蛋白周转，因为溶酶体抑制剂NH4Cl有效地阻止了Yki蛋白的降解。作者分离了细胞质和核蛋白，并测试了Yki蛋白的降解情况。有趣的是，细胞质Yki通过溶酶体被破坏稳定，而核Yki则通过蛋白酶体降解。为了进一步验证这一结果，作者在Yki的C端融合了一个核定位序列（NLS），生成了Myc-Yki-NLS变体，该变体主要定位在细胞核中，并发现它主要通过蛋白酶体来破坏稳定。另一方面，作者还通过在Yki的N端添加一个肉豆蔻化信号，生成了一个膜拴住的Yki形式（Myc- Myr-Yki），它专门定位在细胞质中，并且发现它被溶酶体降解。这些结果表明，细胞质的Yki蛋白经历溶酶体的周转，而核Yki主要经历蛋白酶体介导的蛋白分解。
Usp7特异性地与Yki结合，其去泛素酶活性是Usp7调节Hpo途径所不可缺少的，这意味着Usp7可能是维持Yki蛋白稳定性的必要条件。与此相一致，Usp7确实阻止了Yki和Yki-NLS的降解。相反，敲除usp7会加速Yki的降解。另一方面，Usp7以去泛素酶活性依赖的方式增加了核Yki的丰度，而对细胞质Yki蛋白没有明显影响。
作者接下来试图用一种基于细胞的泛素化试验来确定Usp7是否能使Yki去泛素化。作者发现，敲除usp7会增加Yki的泛素化。相反，Usp7和Usp7-ΔMATH都减少了Yki的泛素化，而Usp7-CA促进了Yki的泛素化。由于Usp7主要定位在细胞核中，它很可能使核Yki去泛素化。作者将细胞质和核蛋白分开进行泛素化试验，发现Usp7对核Yki进行了强有力的泛素化，而对细胞质Yki则没有。
研究结论：核Yki蛋白经历了泛素化介导的周转，这被Usp7所拮抗。
6.哺乳动物的Usp7在功能上是保守的
已经证明，Yki的哺乳动物直系亲属Yap经历了β-transducin重复蛋白（β-TrCP）介导的泛素化和蛋白酶体依赖的蛋白分解。为了测试Usp7对Yki的调控是否在功能上是保守的，作者将人类中usp7的近似物hausp克隆到UAS-Fg骨架载体上，生成UAS-Fg-hausp转基因苍蝇。共同IP试验显示人HAUSP可以拉低果蝇Yki。通过En-gal4对hausp的过量表达可以上调ban-lacZ和diap1-lacZ的水平，这意味着HAUSP也是Yki靶基因的一个正向调节因子。
作者接下来确定HAUSP是否在哺乳动物细胞中调控Yap的稳定性和Hpo通路的活性。共同IP结果显示，外源Myc-Yap与293T细胞中的外源Fg-HAUSP相互作用。此外，在293T细胞中，内源性Yap可以拉低内源性HAUSP，反之亦然。此外，作者发现，无论是敲除还是过度表达已知的HAUSP靶基因（p53、gli1、gli2、gli3和N-Myc），都没有对Yap蛋白水平产生任何可察觉的影响，排除了HAUSP通过这些转录因子间接稳定Yap的可能性。
与以前的研究一致，β-TrCP确实以剂量依赖的方式降解Yap，这被HAUSP阻断，但不被HAUSP-CA（一种去泛素酶缺陷形式）阻断。作者接下来试图测试HAUSP是否在哺乳动物细胞中对Yap进行去泛素化。正如预期的那样，HAUSP确实降低了Yap泛素化水平，而HAUSP-CA则发挥了相反的作用。此外，作者进一步发现，HAUSP以一种依赖去泛素酶的方式阻止了β-TrCP介导的Yap泛素化。HAUSP拮抗Yap泛素化和降解的能力意味着HAUSP可能影响Hpo途径的活性。为了验证这一假设，作者进行了实时RT-qPCR实验，发现敲除hausp后，Yap的靶基因，包括AREG、CTGF和Cyr61的表达减少，而hausp的过表达则升高。hausp的敲除和过表达都不影响yap mRNA水平，支持HAUSP通过稳定Yap蛋白来调节Yap。
研究结论：Usp7对Yki的调控在功能上是保守的。
7.哺乳动物的Usp7在功能上是保守的
作者的上述研究已经证明Usp7/HAUSP在果蝇和哺乳动物细胞中调节Yki/Yap的稳定性和Hpo途径的输出。为了测试HAUSP是否有助于肿瘤的发生，作者选择了干细胞癌（HCC）标本，因为肝脏对Hpo信号的变化特别敏感。作者评估了60对匹配的肝脏组织样本的HAUSP蛋白水平。与以前的研究结果一致，与相应的正常肝脏相比，60个HCC肿瘤中的49个HAUSP呈上调状态。作者进一步检查了这些样本中Yap的水平，发现HCC样本中Yap的水平（60个中的51个）高于匹配的非肿瘤组织。此外，发现HAUSP和Yap在蛋白水平上有很强的正相关。一致的是，RT-qPCR结果显示，Yap靶基因的表达在HCC样本中确实升高了。
为了探索HAUSP是否参与调控Hpo途径和HCC的肿瘤发生，作者采用了HCC细胞系Huh7。转染HAUSP显然增加了Yap靶基因的mRNA水平，而HAUSP-CA没有这种作用。一方面，hausp的敲除抑制了Yap靶基因的表达。另一方面，HAUSP的转染促进了Huh7细胞的增殖，而HAUSP-CA没有显示出任何影响。HAUSP的基因敲除阻碍了Huh7细胞的增殖，而Yap的过表达又使其恢复，这表明HAUSP通过Yap促进了Huh7细胞的增殖。
P5091引发了多发性骨髓瘤细胞的凋亡，并通过抑制HAUSP的活性克服了硼替佐米的耐药性。作者接下来想测试该抑制剂是否能调节Yap蛋白的丰度，然后调节HCC细胞的增殖。研究发现P5091以浓度依赖的方式减少Yap蛋白，但不影响HAUSP蛋白。一致的是，P5091处理也下调了Yap目标的蛋白水平，包括AREG和Cyr61。此外，作者进行了MTT实验，发现P5091以剂量依赖的方式减弱了Huh7细胞的增殖。作者还选择了其他特异性的Usp7抑制剂（Usp7-IN- 155和HBX-1981856）来验证实验结果。与P5091类似，Usp7-IN-1和HBX-19818以剂量依赖的方式减少Yap蛋白，而不影响HAUSP水平。这些抑制剂都可以缓解HAUSP对Yap的去泛素化作用。
研究结论：作者的结果显示，HAUSP通过稳定Yap来积极调节HCC的肿瘤发生，为HCC的临床治疗提供了HAUSP抑制剂这一潜在药物。
在这项研究中，作者证明了去泛素化酶Usp7通过去泛素化Yki来积极调节Yki靶基因的表达。作者提供了Usp7与Yki结合的生化证据，它被Hpo或Wts所抑制。这些结果表明，Hpo信号不仅阻止了Yki的核积累，而且还通过削弱Yki-Usp7的相互作用促进了Yki的核降解。此外，哺乳动物的同源物HAUSP在控制Hpo通路转导中发挥了保守的作用。最后，作者发现，临床HCC样本显示HAUSP蛋白和Yap蛋白增加，hausp-siRNA或HAUSP抑制剂治疗阻碍了HCC细胞系的增殖。因此，作者的研究结果揭示了一个保守的机制，即DUB稳定Yki以实现最佳的Hpo途径输出，并提供HAUSP作为Hpo相关癌症治疗的潜在药物靶点。
结论与讨论
在这项研究中，作者发现usp7在果蝇的不同发育阶段以Hpo途径独立的方式稳定表达，这表明Usp7可能是Yki的组成型调节因子，没有上下文特异性。作者的数据认为， Yki蛋白的体内平衡受Hpo途径活性支配。当Hpo信号关闭时，Usp7使核Yki稳定下来以打开靶基因的表达。一旦Hpo通路被激活，它不仅通过磷酸化Yki抑制Yki核易位,而且通过减弱Usp7-Yki亲和力而降低核Yki蛋白。因此, Hpo途径可能通过双重机制削弱了Yki的功能。
Thank you!
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-019-08334-7
