Usp9X在树突棘发育过程中控制ankyrin重复域蛋白质稳态

写在前面

        今天推荐的是由美国西北大学 Feinberg 医学院在2020年2月5日发表于Neuron（IF：17.173，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Peter Penzes教授，研究表明Usp9X在树突树突棘发育过程中控制ankyrin重复域蛋白质稳态。

研究背景

        编码ankyrin-G（Ankyrin-G）的 ANK3 基因变异与神经发育障碍有关，包括智力障碍、自闭症、精神分裂症和双相情感障碍。Ankyrin-G在多个神经生物学过程中发挥重要作用，包括突触发生、突触可塑性、动作电位的产生和传递以及离子通道调节。然而，突触处ankyrin-G的上游调节剂尚不清楚。

摘要部分

        在这里，作者展示了ankyrin-G与Usp9X（一种去泛素化酶 (DUB)）相互作用。Usp9X磷酸化增强了它们的相互作用，减少了ankyrin-G多聚泛素化，并稳定了ankyrin-G以维持树突棘发育。在前脑特异性Usp9X基因敲除小鼠 (Usp9X–/Y) 中，ankyrin-G以及包含多个ankyrin重复结构域 (ANKRD) 的蛋白质在出生后2周时暂时减少，但在出生后12周时恢复。然而，敲除后皮质棘密度的降低会持续到成年期。Usp9X–/Y小鼠表现出ankyrin-G泛素化和聚集以及活动过度的增加。智力障碍和自闭症患者的Usp9X突变会消除其催化活性或ankyrin-G相互作用。作者的数据揭示了ANKRD蛋白稳态的 DUB 依赖性机制，其损伤仅暂时影响ANKRD蛋白水平，但会导致持续的神经元、行为和临床异常。

研究内容

1.Ankyrin-G稳定性受泛素化调控，其ANKRD与Usp9X相互作用     

        为了鉴定ankyrin-G的调节因子，作者使用其ankyrin重复序列作为诱饵进行 了酵母 2-杂交筛选。作者鉴定了Usp9X DUB 的肽酶结构域 (aa1719–1842)，由Usp9X编码。作者通过小鼠皮层的共免疫沉淀证实了它们在体内的相互作用，并将ankyrin-G的ANKRD和调节域映射为与Usp9X的肽酶域的相互作用位点。Ankyrin-G 包含七个D box。将ankyrin-G的ANKRD穿入ankyrin-B 结构发现保守的赖氨酸暴露在溶剂中，进一步支持它们可用于泛素化。事实上，用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理培养的皮质神经元导致ankyrin-G水平增加，表明ankyrin-G被蛋白酶体降解。因为ANKRD是高度多泛素化的，作者进一步关注这个域。

        ANKRD中一个或两个 D box或赖氨酸的突变减弱了MG132对HEK293T细胞中ANKRD多泛素化的影响。作者在蛋白质合成抑制剂放线菌酮存在下通过延时成像比较了野生型 (WT) GFP-ankyrin-G1-807 与其D box突变版本的神经元的降解动力学。D 盒突变体表现出比 WT GFP-ankyrin-G1-807 更慢的降解，表明ankyrin-G稳定性受其ANKRD的Cdc20/APC依赖性泛素化调节。

研究结论：Ankyrin-G稳定性受泛素化调控，其ANKRD与Usp9X相互作用。

2.超分辨率成像揭示了Ankyrin-G和Usp9X空间组织和树突棘结构之间的关系     

        Usp9X与体细胞树突隔室中的ankyrin-G高度共定位。作者采用结构化照明显微镜 (SIM) 来分析ankyrin-G和Usp9X的精确空间组织。观察发现，多个ankyrin-G纳米域与突触周围区域的Usp9X斑点相邻或重叠。大多数棘在Usp9X周围表现出两个或多个ankyrin-G纳米域。

        为了探究ankyrin-G和Usp9X纳米域的定位如何与树突棘形态相关，尽管Usp9X存在于46.0%的树突棘头部，但仅在9.1%的树突棘颈部观察到了Usp9X。Ankyrin-G纳米域存在于89.4%的树突棘头部和 52.0% 的树突棘颈部，并且树突棘头部大小与树突棘头部和颈部中ankyrinG的存在相关。每个树突棘的Usp9X纳米域数量与树突棘头部区域相关，而每个树突棘的Usp9X纳米域总面积与树突棘头部大小以及树突棘头部内ankyrin-G纳米域的数量和大小相关。

研究结论：多个ankyrin-G纳米域与突触周围区域的Usp9X斑点相邻或重叠。

3.Usp9X通过Ankyrin-G稳定调节树突棘形态

        最近的研究表明Usp9X在神经元发育中发挥作用。因此，作者研究了Usp9X表达水平对成熟培养的皮层神经元中树突棘形态的影响。Usp9X敲低导致树突棘头部大小和密度显着降低。相反，其肽酶结构域的过度表达导致树突棘头部增大并回补了Usp9X敲低对树突棘密度的影响。此外，Usp9X肽酶结构域的过表达减弱了MG132 诱导的泛素化ankyrin-G的增加。此外，ankyrin-G与两个突变D盒的表达增加了对照神经元中的树突棘大小，并挽救了表达 shUsp9X的神经元中的树突棘密度。

研究结论：Usp9X介导的去泛素化稳定了ankyrin-G水平并维持了树突棘结构。

4.磷酸化增强了Usp9X与Ankyrin-G的相互作用     

        作者假设Usp9X的磷酸化可能会改变蛋白质之间的相互作用。为了研究磷酸化在调节Usp9X和ankyrin-G相互作用中的作用，作者基于Usp9X的晶体结构预测了可能的模型。     

        为了确认作者的同源性建模的预测，作者使用了原位邻近连接分析 (PLA)，它在 16 nm 距离内标记蛋白质 - 蛋白质相互作用。在基础条件下，PLA 信号表明ankyrin-G1-807 和Usp9X1555-1958的相互作用，但在磷酸空Usp9XS3A 共表达时不存在。相反，测试了每个丝氨酸（S1598D、S1600D、S1608D）的单个拟磷突变，并且 S1608D 与ankyrin-G的相互作用显着增加。此外，所有三个丝氨酸位点 (Usp9XS3D) 的诱变显示出最强大的增强。为了测试这些残基的突变是否会改变Usp9X的活性，作者使用重组表达的小鼠Usp9X 以及Usp9XS3A 和催化无效构建体Usp9XH1878A 开发了一种体外 DUB 测定。每个Usp9X拟磷突变体都显示出与ankyrin-G的相互作用增强，但它们的催化活性在体外没有改变。     

        为了研究Usp9X磷酸化在树突棘中的作用，将Usp9XWt 或Usp9XS3A 与对照 RNAi 或 shUsp9X构建体共转染到皮层培养的神经元中。GFP-Usp9XS3A 的过表达显着降低了棘的大小和密度，而 WT Usp9X1555-1958 的过表达回补了shUsp9X对棘的影响。这些数据表明Usp9X肽酶结构域的磷酸化可调节棘头部的大小和密度。

        PLA 方法允许在空间和定量上可视化相互作用的蛋白质。为了观察神经元中内源性ankyrin-G和突变的Usp9X的相互作用模式，作者用WT或S3D或S3A过表达FLAG-Usp9X。在HEK293T细胞中过表达，Usp9XS3D 中的 PLA 信号增加。因为原位 PLA 允许在空间和定量上可视化相互作用的蛋白质，作者开发了一种将 PLA 与 SIM (PLA-SIM) 相结合的方法来研究棘内Usp9X-ankyrin-G相互作用的空间组织及其与棘大小的关系。有趣的是，Usp9XS3D 增加了表达ankyrin G 的棘的比率，同时增加了 PLA 阳性棘，并促使棘密度增加。表达ankyrin-G的树突棘头部明显大于没有ankyrin-G的树突棘头部。

研究结论：磷酸化增强了Usp9X与Ankyrin-G的相互作用。

5.Usp9X在体内稳定多种ANKRD蛋白     

        作者在体内研究了原生小鼠大脑背景下ankyrin-G-Ups9x 相互作用的生理学。作者检查了它们在小鼠初级体感皮层中的免疫荧光发现，ankyrin-G和Usp9X之间的重叠在树突区域最强，而不是轴突初始段 (AIS)。Ankyrin-G和Usp9X在皮质层 II-III、IV 层和 V 层中共同表达。   

        为了评估Usp9X在维持ANKRD蛋白稳态中的作用，作者分析了来自2周和12周大的 EmxDUsp9X条件性敲除小鼠的皮层裂解物，这些小鼠在背侧端脑 (Usp9X-/Y) 中缺乏Usp9X。蛋白质印迹显示，与 WT 小鼠 (Usp9X+/Y) 相比，2 周时ankyrin-G的水平显着降低。

        因为ANKRD是许多蛋白质的共同域，作者想知道其他ANKRD蛋白质的水平是否也受到影响。作者发现Usp9X-/Y 小鼠的ankyrin B、Shank3 和 TNKS2 水平也显着降低，表明Usp9X在体内稳定多种ANKRD蛋白。为了估计去泛素化是否可能在调节含有ANKRD的突触蛋白的蛋白质稳态中发挥更广泛的作用，作者进行了生物信息学分析。作者发现ANKRD蛋白编码基因在来自BD GWAS的全基因组显着位点和与ASD和SZ相关的de novo变体中显着富集，表明在神经精神疾病中具有更广泛的作用。在涉及神经精神疾病的 59 种ANKRD蛋白中，据报道有20种在ANKRD中含有泛素化赖氨酸残基，表明它们的蛋白稳态可能通过 UPS 和 DUB 进行调节。

研究结论：Usp9X在体内稳定多种ANKRD蛋白。

6.Usp9X的缺失导致小鼠皮层树突树突棘密度的持续降低和Ankyrin-G泛素化和聚集的增加   

        与降低的ANKRD蛋白水平一致，与Usp9X+/Y 相比，出生后2周Usp9X-/Y 小鼠额叶皮层III层的树突棘密度显着降低。令人惊讶的是，尽管Usp9X底物蛋白水平恢复，但12周大的Usp9X-/Y小鼠的树突棘密度仍然降低。作者还通过IP等实验发现，在 2周龄时，ankyrin-G泛素化在WT和Usp9X-/Y小鼠中相似；然而，通过先天表达的免疫沉淀ankyrin-G的标准化比率显示Usp9X-/Y小鼠中泛素化ankyrin-G的显着增加。在第 12 周时，Usp9X-/Y皮质中的ankyrin-G泛素化显着高于 WT。

        为了研究 12 周时Usp9X-/Y 皮层中ankyrin-G泛素化水平增加之间的明显矛盾，作者检查了ankyrin-G的分布。作者检查了Usp9X-/Y和Usp9X+/Y小鼠额叶皮层中ankyrin-G的分布。2周后，与Usp9X+/Y小鼠相比，Usp9X-/Y小鼠的ankyrin-G免疫荧光降低。然而，令人惊讶的是，在 12 周时，ankyrin-G在Usp9X-/Y小鼠中显着地重新分布成大的聚集体，这表明，虽然整体ankyrin-G水平恢复，但大部分隔离在大的聚集体中，可能是由于超泛素化。

研究结论：Usp9X在出生后发育过程中调节ANKRD蛋白稳态和树突棘形态发生中起着关键作用，其影响持续到成年。

7.Usp9X-/y小鼠在行为测试中表现出更高的活动水平

        作者接下来研究这些生化和解剖学改变是否也与神经发育障碍相关的行为表型有关。编码ANKRD蛋白的基因缺失的小鼠共有的表型域包括焦虑和运动活动水平的异常。因此，作者在Usp9X-/y 小鼠中研究了这些行为表型。首先，Usp9X-/y 小鼠的体重和新陈代谢正常。与对照相比，Usp9X-/y 小鼠在测试期间表现出更高的活动水平。与多动症行为相一致，Usp9X-/y小鼠在高架迷宫和光/暗箱试验中也分别表现出每臂进入次数和试验室转换次数的显著增加。在强迫游泳试验中也观察到较少的固定化现象。

研究结论：Usp9X-/y小鼠在行为测试中表现出更高的活动水平。

8.Usp9X催化域中的人类突变损害其活性和与ankyrin-G的相互作用     

        由于USP9X的突变发生在ID、ASD和癫痫患者身上，作者想探究催化结构域的这种突变是否影响与ankyrin- G的相互作用和/或DUB活性。作者测试了重组蛋白与ankyrin-G的相互作用能力。在一名发育障碍（DD）和语言迟缓的患者身上检测到的Q1573L突变，以及在一名患有ID、DD和ASD的患者身上检测到的L1693W突变，显示出与ankyrin-G的正常相互作用，但在催化上没有活性。     

        基于已知DUB结构的人类Usp9X同源模型表明 Q1573 和 L1693 位于紧密的内部疏水核心内，这些残基的突变导致肽酶结构域内的空间冲突。这与观察到的热力学稳定性增加一致，表明结构灵活性降低，这一发现可能是催化活性改变的基础。相反，表面暴露的突变G1890E不会影响体外蛋白质结构或催化活性，但会破坏与ankyrin-G的相互作用，表明该突变可能通过改变蛋白质-蛋白质相互作用产生影响。

研究结论：Usp9X催化域中的人类突变损害其活性和与ankyrin-G的相互作用。

结论与讨论

        作者通过筛选发现ankyrin-G与Usp9X相互作用。磷酸化增强Usp9X/ankyrin-G相互作用，减少ankyrin-G多泛素化，并稳定ankyrin-G，以维持树突棘。超分辨率显微镜揭示了该通路的突触后空间组织。在前脑特异性Usp9X条件性敲除(Usp9X-Y)小鼠中，多种ANKRD蛋白的水平在2岁时暂时降低， 但在出生后12周时恢复。作者的数据提供了对突触中含有ANKRD蛋白质的稳态调节以及突触DUB生物学的洞察。总之，研究结果表明，在突触成熟的整个生命周期中去泛素化对于皮层突触的正确发育轨迹至关重要，其改变导致行为和临床异常。

Thank you!

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.11.003