《Circulation》功能性钙螯合蛋白 Casp-1 调控恶性高热样心律失常的机制研究

首都医科大学罗大力教授团队在 Circulation 杂志发表了题为“Functional Calsequestrin-1 Is Expressed in the Heart and Its Deficiency Is Causally Related to Malignant Hyperthermia-Like Arrhythmia”的文章，阐明了异氟烷或高热造成的 Casq1 解聚化可降低其对雷诺定受体 2(Ryanodine receptor-2, RyR2)介导的钙释放的抑制作用，从而引起恶性高热(malignant hyperthermia, MH)和环境中暑(environmental heat stroke, EHS)样心律失常。

背景：

钙螯合蛋白(Casqs)，包括 Casq1（骨骼肌型）和 Casq2（心肌型）两种亚型，可以分别缓冲 Ca2+、调节在骨骼肌和心肌肌浆网（sarcoplasmic reticulum，SR）内钙的释放。Casq1 或 Casq2 突变可导致人类遗传疾病包括 MH/ EHS 和儿茶酚胺能多态性室性心动过速（catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT)）。

CPVT 的 主 要 诱 发 原 因 是 心 肌 SR 中 编 码 RyR2 (ryanodinereceptor-2) (Ca2+释放通道的组成部分)和 Casq2 (calsequestrin-2) (Ca2+缓冲蛋白)的基因突变。舒张期过早自发性 SR Ca2+释放、Na+/Ca2+交换体激活和去极化迟后除极(DADs)的产生是发生 CPVT 的高风险因素。MH/EHS 是一种遗传性亚临床肌肉病，由挥发性麻醉药、去极化肌肉松弛剂、剧烈运动、发热引发，包括心动过速、高碳酸血症、肌肉强直、高热、酸中毒和横纹肌溶解等症状。丹曲林，一种 RyR 拮抗剂，是专门用于治疗 MH/EHS 的药物。尚未在心脏中检测到 Casq1 蛋白表达，但 Casq1 基因在人类心脏和大鼠心室表达的线索已被揭示，Casq1 内含子 2 的变异与白种人的静息心率加快有关。因此，作者假设 Casq1 也在心脏中表达，且可作为独立致病因素，在其改变时，探究是否可引起 MH/EHS 样心律失常。

关键词：

麻醉药、心律失常、钙螯合蛋白、恶性高热、CPVT、聚合反应

方法：

RT- PCR、western blot、免疫共沉淀、化学交联、电标测 Electrical Mapping

一、野生型和 Casq1-KO 小鼠在麻醉后被肝素化并处死。

二、快速切除心脏并安装在 Langendorff 装置上，通过主动脉逆行灌注Tyrode 溶液，其中含有（以 mmol/L 为单位）NaCl 137、KCl 5.4、MgCl2 1.2、NaH2PO4 1.2、D-葡萄糖 10、HEPES 20 和 CaCl2 1.8（pH7.4)，用 95% O2-5% CO2 气体混合物充氧，温度保持在 37ºC。稳定10 分钟后，进行心电图记录。

三、测量心电图后，将 64 个电极（8×8 个网格；6 mm×6 mm 面积；0.20 mm 电极直径；0.36 mm 电极间距）与电标测系统（MappingLab,United Kingdom)用于记录窦性心律下左心室游离壁的心外膜标测。

四、使用 EMapRecord 记录标测数据并通过 EMapScope 软件进行分析。

结果：

1、Casq1 亚型在小鼠和人心脏中的表达

作者通过 western blot、免疫染色、化学交联等技术，分析了 Casq1在大鼠和小鼠心脏、乳鼠心肌细胞（NRVMs）和大鼠胚胎心肌细胞系(H9C2)中的表达来研究 Casq1 是否在心脏中表达。

研究发现，Casq1 mRNA 和蛋白在所有组织和细胞裂解液中的表达低于 Casq2(图 1A 和 1B)；在小鼠心室和心房的 SR 中，Casq1 以低分子量单体和高分子量样蛋白的形式大量表达，这可能是骨骼肌中Casq1 的聚合形式(图 1C)；进一步通过试剂交联法分析，Casq1 主要以聚合物的形式出现，而 Casq2 则以其单体、二聚体和三聚体构象存在(图 1D)。Casq1 蛋白在二尖瓣反流和心肌肥厚患者的心耳和心室中也有表达，心室中 Casq1 被修饰成更大的分子量(图 1E)， Casq1 单体在人心耳和小鼠心室中也被发现具有相似的分子量。对小鼠心室和心肌细胞的免疫染色分析表明，在 Casq1 染色的心室中观察到细胞间隙的非特异性标记，但在分离的心肌细胞中没有观察到标记(图 1F)。

2、异氟烷诱导 Casq1-CKO 和 Casq1-KO 小鼠 MH 样心动过速

为了确定 Casq1 在心脏中的功能，作者构建了心脏特异性敲除(Casq1- cko)和全身敲除(Casq1- ko)小鼠模型，并通过心电图与电标测技术检测两种小鼠在异氟烷诱导下是否出现 MH 样心动过速。

结果显示，1%异氟烷存在时，Casq1-KO 和 Casq1-CKO 小鼠的基础心率增加，异丙肾上腺素（ISO）刺激交感神经后，小鼠的心率加快(图 2A-C)，但无 Casq2-KO 小鼠中发现的任何 CPVT 迹象。在Langendorff 灌注心脏中，心电图显示窦性心率增加(图 2D)和在体结果相似。此外，心外膜电标测在同一 Casq1-KO 或 Casq1-CKO 小鼠中显示出异位自发放电和频繁的室性早搏或偶发性室性心动过速(图2E)，提示异常放电和心动过速与躯体神经调节无关。异氟烷用量增加到 2%时, 在病人和动物模型中均可诱导 MH 事件, Casq1-KO 和Casq1-CKO 小鼠表现出丹曲林敏感的室性早搏和单向室性心动过速(图 2B 和 2C)，与 Casq2 缺陷小鼠和暴露于诱导剂的多型或多态室性心动过速患者的 CPVT 不同。

3、升高的 Ca2+波和过早的 Ca2+瞬变是 MH 样心律失常的原因

SR 中 Ca2+含量和循环的紊乱可能导致细胞电稳态紊乱，从而诱发 DADs 和 EADs。作者通过共聚焦技术检测了 Casq1-CKO 小鼠新鲜分离和刺激条件下的心肌细胞内的 Ca2+活性。

结果显示，与 WT 小鼠的心肌细胞相比(图 3A)， Casq1-CKO 小鼠心肌细胞在基础状态下表现出更高的舒张期 Ca2+早期瞬变(PCT)和Ca2+振荡(CO)频率，并且在 2%异氟烷下，PCT 和 CO 频率显著增加。

在本研究中，局部或全部 Ca2+提前释放通常是一个持续的过程，影响Ca2+基线的平稳(图 3A1);因此，异氟烷诱导的 Ca2+异常信号被分为两种类型:即 PCT 和 CO。在 Casq1-CKO 肌细胞中，单个细胞 Ca2+瞬态间歇期间的 PCT 发生率要高得多(图 3A3)。与对照组相比，Ca2+瞬变的基线和振幅没有改变，无论异氟烷是否存在，达到 50%峰值的时间均显著减少(图 3B)。Casq1-CKO 肌细胞和异氟烷触发的 Ca2+火花和钙波(遍及整个细胞)的增加，在异氟烷存在时尤为显著(图 3C)。研究发现，在基线和异氟烷处理的 Casq1-CKO 心肌细胞中，SR Ca2+泄漏与对照组相比没有差异，对照组和 Casq1- CKO 肌细胞 Ca2+泄漏指数增加与 SR Ca2+含量增加的关系无明显差异(图 3D)。

4、Casq1-KO 小鼠中 RyR 活性的上调与室性心律失常有关

既往研究表明，Casq1 和 RyR1 通过支架蛋白 triadin 和 junctin 相互作用，跨越 SR 膜，并通过其腔域结合到骨骼肌中的 Casq1 和 RyR1。为了研究 Casq1 与心脏 SR 蛋白的关联，作者用免疫印迹实验进行了验证，为了进一步研究 Casq1/RyR2 在心脏中的关系，作者使用 Casq1-siRNA 分析 Casq1 表达改变与功能异常之间的关系，使用过度表达Casq1 (Casq1- wt)或编码 Casq1 Ca2+结合域的剪切 Casq1 基因(c -末端9 个氨基酸[Casq1- Δ9])，腺病毒转染培养的 NRVM Casq1 mRNA 和蛋白表达，检测其相关关系。

结果显示，Casq1-CKO 小鼠中 Casq1 单体/二聚体与 RyR2 的相互作用显著减少，但与 WT 相比，聚合物与 RyR2 的相互作用和共定位在心室中保持不变(图 4B 和 4C)。

结果显示，在 Casq1 敲低的细胞中，Junctin 的表达减少 (图 5A和 5B)。与 Casq1-wt 细胞相比，Casq1-Δ9 细胞中发现了大量的 Casq1单体，但较少的聚合物(图 5C)。Casq1-wt 细胞中 RyR2 的表达下降，而 Casq1-Δ9 细胞中则没有。Casq1-Δ9 细胞中 triadin 和 junctin 的表达减少，这可能是由于剪切干扰了其与 triadin/junctin 的相互作用导致(图 5D)。

功能评估显示，在 Casq1 敲除细胞中，2%的异氟烷存在下，窦性自发 Ca2+瞬变增加，Ca2+振荡增加，并且 SR 中咖啡因诱导的 Ca2+释放含量和达到 50%峰值的时间降低(图 6A)。相反，Casq1-wt 转染的细胞，与载体转染的细胞相比，Ca2+瞬时速率和振幅降低，SR 中Ca2+含量更高(图 6B)。在 Casq1 敲除的细胞中，2%的异氟烷也会增加 Ca2+火花(图 6C)，而 Casq1 过表达的细胞中窦性钙火花会减少，Casq1-Δ9 转染的细胞中则没有减少(图 6D)。

5、异氟醚或环境热引起的 Casq1 解聚可导致 MH/EHS 样心律失常

最后，作者调查了为什么 MH/ EHS 样心律失常是由特定的诱因如异氟烷和高热引起的。由于 Casq1 的构象对其功能的实现非常重要，作者采用了交联法检测 WT 心室中 Casq1 的构象是否在 2%异氟醚下发生改变。

结果显示，正常心室在异氟烷处理，而未使用 ISO 治疗的情况下，Casq1 以单体形式存在较多，聚合物形式较少，并显示出高分子量(在800 kDa) RyR2 复合体减少，而 Casq2 保持不变的构象（图 7A）。异氟烷存在时，Casq1- CKO 心室发生更多的解聚反应(图 7B)。通过交联法和 Western blot 分析发现，异氟烷存在下，Casq1 和 Casq1/RyR2复合物(800 kDa)显著下降(图 7C)，表明 Casq1 与 RyR2 的结合被破坏。41℃加热时，WT 心室中也发现了较强的 Casq1 寡聚甚至变性(图 7D)，这是易感患者 EHS 的诱导剂。为了避免组织对热的反应，作者直接处理大鼠心室和腓肠肌的 SR 裂解液，41℃加热，观察到大鼠两种类型的肌肉中Casq1显著的寡聚(图8A)，就像在小鼠中观察到的一样(图7D)。综上所述，Casq1 的构象变化对挥发性麻醉剂和高温敏感。

结论:

本文首次证明了 Casq1 在心脏中表达且可缓冲肌浆网 Ca2+和调节基础心率。Casq1 缺乏可导致窦性心动过速、舒张期自发性钙释放增加和可诱导的室性心动过速。异氟烷和高热是 MH/EHS 的特异性诱因，可引起 Casq1 寡聚化，降低其对 RyR 的调节作用，从而在MH/EHS 患者中引起室性心动过速。

解析文献：

[1] Sun, Z. , Wang, L. , Han, L. , Wang, Y. , & Luo,D. . Functional calsequestrin-1 is expressed in the heart and its deficiency is causally related to malignant hyperthermia-like arrhythmia. Circulation,144(10), 788-804.