免疫沉淀技术之染色质免疫共沉淀（ChIP）

  前两期我们介绍了免疫沉淀技术中用于研究蛋白与蛋白相互作用的免疫共沉淀，然而可以与蛋白质相互作用的不只有蛋白质，还有DNA和RNA等。本期将重点介绍蛋白质与DNA相互作用的研究方法，染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是目前唯一研究二者互作关系的技术。ChIP可以完整真实地反映细胞中特定蛋白与DNA的结合关系，将蛋白-DNA复合物分离出来进一步研究特定的结合蛋白或与其结合的DNA，结合qPCR（ChIP-qPCR）可实现定量分析，结合二代测序（ChIP-seq）可对目标DNA进行测序分析等。

ChIP实验原理

       ChIP的基本原理与Co-IP类似，即用DNA结合蛋白的抗体去沉淀得到蛋白-DNA复合物。简单讲，使用甲醛将活细胞固定，以保留细胞内的蛋白-DNA复合物，随后采用超声或核酸酶将DNA随机切断成一定长度的小片段，接着用特定蛋白抗体结合并富集蛋白-DNA片段复合物，最后将复合物纯化、解联后检测得到的DNA片段。

ChIP一般实验流程

       由于不同公司的ChIP实验试剂盒操作细节不同，根据所使用的试剂盒进行实验操作剂盒，这里整理的一般实验过程，可以先大致有个整体参考了解。

图 ChIP实验流程和分析方法[1]

1、  固定细胞（交联染色质）

ChIP检测首先需要将蛋白-DNA复合物固定，最常用1%甲醛溶液进行固定，固定作用是可逆的。固定时间需要注意，时间过长会导致染色质难以切断且得不到合适的长度，时间过短可能会导致固定不足。甘氨酸可以终止交联反应。若细胞固定后暂时不能继续实验，可将细胞保存至-80℃。

2、  细胞裂解

固定、收集细胞后，加入细胞裂解液裂解细胞。

3、  切断染色质

将细胞裂解液通过机械超声或微球菌核酸酶消化切断DNA，得到平均大小为200-1000bp的染色质小片段。这一步得到的染色质片段可在-80℃下保存3个月左右。

4、  免疫沉淀

将目的蛋白的特异性抗体固定在磁珠上，与蛋白－DNA复合物在4℃摇床孵育过夜，离心去上清后得到蛋白－DNA复合物；然后用洗涤缓冲液洗涤沉淀物三次，每次洗涤后需离心去上清。

5、  洗脱、富集蛋白-DNA复合物

  在洗涤好的沉淀复合物中加入洗脱缓冲液，以洗脱DNA，再离心收集上清液。

6、  解交联、纯化DNA

  用NaCl和蛋白酶K解除蛋白与DNA之间的交联，还可使用RNase A以去除残余RNA。通过PCR将DNA进行纯化回收。

7、  分析检测

纯化得到的DNA通过ChIP-qPCR或ChIP-seq进行分析。在已知靶基因区域时，可针对该区域设计qPCR引物，通过ChIP-qPCR可进行快速的定量分析；若是不确定靶基因的情况下，可通过ChIP-seq来检测分析DNA片段。

以上即是ChIP实验的原理和一般实验流程，下期我们将进一步介绍ChIP相关内容，欢迎大家持续关注。汉恒生物专注病毒包装十余年，若有任何相关需求或技术问题欢迎随时与我们联系~

参考文献：

[1] Collas P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 2010 May;45(1):87-100. doi: 10.1007/s12033-009-9239-8.