WB实验

Western Blot实验步骤-第一天 1.配制电泳液、转膜液（用干粉配制） 2.拆开预制胶（注意胶下方是不是有胶条要撕掉，看好说明书），将胶板安装入电泳槽，倒满电泳液，胶板内部倒满，外侧适量即可）。用移液枪将制备好的蛋白样品注入孔道中。以如下顺序加样：marker（5 μl） 样品（10 μl）1 2 3 4 5 6 7 8 marker（5 μl） marker（2μl) 3.将电泳槽与Power正确连接。设置电压300V，电流50A，后续可调整为70A，电泳到蛋白条带充分展开，Loading移到胶底时可结束电泳。

4.转膜： 1）将多余的胶切去 2）安装转膜装置：取出转膜板，黑板朝下，依次放入海绵，滤纸，胶，NC膜（注：NC膜要提前放入甲醇活化），滤纸，海绵，要将胶与膜之间的气泡除尽，夹紧转膜夹，置于转膜槽中，倒满转膜液(转膜夹放置时主义方向，黑对黑） 3）转膜：将转膜槽与Power连接，设置条件为电压100V，1h，置于倒了冰水放了冰袋的泡沫盒里转膜。 5.封闭：用5%脱脂奶粉封闭，用PBS配制5%脱脂奶粉，将NC膜取出来，根据要跑的蛋白先切膜，放入配制好的牛奶中，摇床上封闭1h。 6.敷一抗：按照说明书稀释一抗，在抗体盒上做好蛋白标记，倒掉封闭液后，条带先用PBS洗1-2次，然后敷一抗（一个孔道5ml），抗体盒放在4℃摇床过夜。 Western Blot实验步骤-第二天 1.把抗体盒先拿出来静置10min，配制TBST，我们实验室是将10✖️的稀释成1✖️的 2.二抗1:10000稀释 3.洗条带：用TBST洗 7min洗5次或10min洗3次 速率70

4.倒掉洗液，用枪头吸干，敷二抗1h 5.敷二抗结束后，用TBST洗3次，一次5min速率90 6.配制显影剂，显影