细胞蛋白提取

①不同处理组细胞转染72小时后，以6孔板为例，弃去培养基，向每孔加入预冷的磷酸盐缓冲液2 ml，轻轻晃动6孔板使细胞充分洗涤，弃去磷酸盐缓冲液。该操作重复3次。吸净残留的磷酸盐缓冲液，避免蛋白裂解液被稀释。

②根据实验需要，按照蛋白裂解液RIPA：A液：B液：C液：P液＝100∶1∶1∶2∶1的比例配制蛋白质裂解液。以6孔板为例，向每孔中加入100 ul蛋白质裂解液，在4℃实验室中放置在摇床上均匀摇晃5 min。

③根据实验需要，一个孔至少准备一个细胞刮，预先清洗细胞刮，并且放入高温烤箱中烘干，待细胞刮上的液体烘干后，将细胞刮取出，放入4℃冰箱冷却。将预冷的细胞刮取出，用力均匀地使用刮板，将细胞刮下，每个角落都要刮到，一个孔刮2 min。用无酶无菌枪头将蛋白裂解液全部转移到1.5 ml无酶EP管中，注意不要残留液体，尽可能将蛋白裂解液全部转移。该操作全部于冰上进行，注意低温，以免影响蛋白质提取质量。

④用50 ml离心管准备一管预冷的磷酸盐缓冲液，用于超声过程中超声波细胞破碎仪的清洗。打开超声波细胞破碎仪，调至2档，将超声波探头放入磷酸盐缓冲液中，打开3秒，清洗超声波探头，将探头移出，用干净纸巾擦干上面残留的磷酸盐缓冲液。将超声波探头伸入EP管中，注意不要碰到管壁和底部，打开超声仪3秒，关闭后抖动超声波探头，将残留的蛋白质裂解液甩下。将超声波探头伸入磷酸盐缓冲液中，打开3秒，清洗，将探头移出并擦干。该操作重复3次，且同一管蛋白样品重复超声的时间间隔为5 min。

⑤将离心机调至4℃预冷，4℃下12 000 rpm/min离心20 min。

⑥动作轻柔地将EP管从离心机中取出，可见蛋白质裂解液上清液和底部沉淀。将上清液全部转移至新的蛋白管中，移液时大致判断蛋白上清液的量，注意不要吸到管子底部的细胞碎片沉淀。按照蛋白裂解液∶5×SDS-Page蛋白上样缓冲液＝4∶1的比例，因为试剂粘稠，在加样前要震荡离心，便于加样。再加入蛋白上样缓冲液，震荡混匀，瞬时离心，使溶液充分混匀混合。在蛋白管上标注实验人员姓名、提取蛋白日期、细胞种类、蛋白管编号等基本信息。

⑦将蛋白管装在浮标上，预先在水浴锅中将水加热至沸腾，再将装有蛋白管的浮标扔进水浴锅中加热，沸水加热20 min。如果需要后续进行western blot实验，则可进行。如果暂不需要进行实验，则将蛋白管放于﹣80℃冰箱进行储存。

Western Blot

1）电泳

①用纯水将玻璃板清洗之后晾干，注意没有胶丝残留在玻璃板上，将玻璃板放在胶架上夹紧，注意短板在外，长板在内，安装好后，在胶板内加入纯水，静置10 min，检查是否有水渗漏。如果不漏，则可进行下一步制胶。如果渗漏，则重新调整玻璃板，重新检漏。

②使用Yeasen公司的免封闭PAGE凝胶快速制备试剂盒（10%）进行制胶。试剂预先放入4℃冰箱中进行保存，不可在常温下放置。以一块1.0 mm胶为例，取2.7 ml的分离胶缓冲液和2.7 ml的分离胶溶液混匀，该过程要操作迅速，并且前期的试管和滴管都必须干净，无液体残留，以免稀释分离胶。再加入45 ul改良型过硫酸铵溶液，此时分离胶容易迅速凝固，充分混匀。在加入所有液体混匀后迅速将分离胶混合液加入制胶玻璃板中。再加入3 ml无水乙醇进行液封，静置20 min。留少许分离胶混合液在离心管中，观察有无凝固。

③在光下观察制胶玻璃板，出现明显的折光线和分层，且离心管中分离胶混合液凝固，则将无水乙醇倒掉，用干净滤纸吸净残留无水乙醇，静置5 min等无水乙醇挥发。此时可配制浓缩胶混合液。取0.75 ml浓缩胶缓冲液和0.75 ml浓缩胶溶液混匀，再加入13 ul改良型过硫酸铵溶液，充分混匀。在加入所有液体混匀后迅速将浓缩胶混合液加入制胶玻璃板中。再轻轻插入梳齿，并在梳齿两侧补适量浓缩胶混合液，静置20 min。留少许浓缩胶混合液在离心管中，观察有无凝固。

④离心管中浓缩胶混合液凝固后，轻轻拔去梳齿。将蛋白样品放在冰上解冻。配制电泳液，并将新鲜电泳液倒入电泳槽中。将制胶玻璃板放入电泳槽中夹紧，使电泳液没过制胶玻璃板的上样孔。蛋白样品解冻后瞬时离心，上样前震荡，枪头伸进前1/3，注意不要戳穿上样孔。如果上样孔有胶丝堵住，则用针头挑开即可。加样时速度先稍慢，确定样品进入上样孔中后稍快地加样。注意样品的两边可加入不同量的蛋白marker，便于分清左右。

⑤红色电线对红色插头，黑色线对黑色插头，连接好后打开电源，可见气泡向上走。调节电压为70 V，约20 min后可见浓缩胶的蛋白marker分开，当样品蛋白被压成一条直线后，调成120 V~130 V，电泳30 min~40 min。最终电泳时间根据实验需要进行自行调整。

2) 转膜

①电泳时可准备转膜使用工具。配制新鲜转膜液，由于甲醇易挥发，可以先不加甲醇，等最后进行转膜时加入甲醇。电泳完毕后将玻璃板从电泳仪中取出，用清水冲洗后，将玻璃板放进润膜液中，防止干燥造成胶破裂。左手托着玻璃板，右手轻轻地将翘板器插入短板和长板之间，切勿用蛮力，小心轻柔地将胶翘到短板上。在翘板过程中要保持翘板器和玻璃板的湿润，否则胶十分容易在此过程中破裂。若一次性转多块胶，其余玻璃板应放在润膜液中，保持湿润状态。如果没有翘板器，可以在润膜液中进行翘板。

②根据实验需要，将所需要的蛋白分子量所在的位置剪切下来，上下至少留2个可辨认且清晰的蛋白marker，便于识别。用直尺比照胶的长度和宽度，脱下接触转膜液的外手套，换上干净的PE手套，根据胶的尺寸进行剪PVDF膜。注意在剪膜时一定不能污染PVDF膜，即使戴了PE手套也不直接接触PVDF膜，避免造成污染。将剪好的PVDF膜放在装有甲醇的盒子内激活2 min。

③将方格纸垫在干净PVDF膜下，用圆珠笔在PVDF的非蛋白面做好标记。将胶放在转膜夹棉垫的正中央偏上，一边滴加转膜液至膜上，保持膜表面湿润，一边将PVDF膜小心地覆盖在胶上。一边向PVDF膜上滴加转膜液，一边检查PVDF膜和胶之间有无小气泡，如果有小气泡，向气泡处滴加转膜液，将气泡挤出去。向膜和胶上滴加甲醇，提高转膜效率。确认无气泡残留之后，将滤纸一层层盖在PVDF膜上，注意不要有气泡，如果有气泡的话就滴加转膜液将气泡赶出去。将转膜夹合上后，切勿再移动转膜夹，扣紧转膜夹，以免PVDF膜和胶之间位置移动并产生气泡，降低转膜效率。

④将转膜夹放进转膜槽中，注意转膜夹白色面对转膜槽红色面，黑色面与转膜槽黑色相对，在转膜槽的空处放入两个冰盒，倒入新鲜配制的转膜液，没过转膜夹。接上电源，注意红色的电线接红色的电极，并且观察电极上有无胶丝液体残留，以免损耗电极，黑色的电线接黑色的电极，将电流调至220 mA，查看电压，电压应<120 V，在转膜槽周围放置足量的冰和冰盒，由于转膜过程中会散热，每隔30 min可以查看一次电流、电压，避免转膜过程中温度过高影响转膜效应，转膜2小时。

3) 免疫学检测

①转膜完毕后，将转膜夹取下，可见PVDF膜上显示DNA marker，而胶上无DNA marker残留。将PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，倒入适量TBST溶液，放在TBST溶液中清洗15 min，弃去TBST溶液。该操作重复3次。

②将PVDF膜转移至平皿中，向皿中加入8 ml封闭液，蛋白面朝上，与封闭液充分接触，封闭液需充分没过PVDF膜。室温下摇床2小时。该操作为降低非特异性结合，让封闭液中的大分子物质封闭无关的蛋白结合位点。

③封闭完成后，弃去封闭液。将PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，放在TBST溶液中清洗15 min，弃去TBST溶液。该操作重复3次。将PVDF膜转移至平皿中，向皿中加入8 ml配置好的一抗溶液，4℃下摇床15小时。如果一抗结合的效率较低或较高，可以根据时间适当调整一抗孵育时间。

④孵育一抗完成后，将一抗溶液回收。将PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，放在TBST溶液中清洗15 min，弃去TBST溶液。该操作重复3次。将PVDF膜转移至平皿中，向皿中加入8 ml配置好的二抗溶液，4℃下摇床2小时。

⑤孵育二抗完成后，将二抗溶液回收。将PVDF膜蛋白面朝上放入盒中，放在TBST溶液中清洗15 min，弃去TBST溶液。该操作重复3次。按照显影液∶定影液＝1∶1的比例配制化学荧光发光液，现配现用，根据实验需要，2个DNA marker之间需要200 uL化学荧光发光液。用镊子夹着PVDF膜的边缘，将PVDF膜从取出，在干净滤纸上小心滤干水液，注意不要污染蛋白面。将蛋白面朝下放在干净且无水的皿中，将化学荧光发光液滴在条带四周，用镊子夹着膜的边缘，轻轻晃动，使蛋白面与发光液充分接触，再将膜翻转，蛋白面朝上，大分子量DNA maker在上，小分子量DNA marker在下，放入曝光仪中。

⑥调整条带位置，让条带处于曝光仪中央。选择合适的曝光时间，进行曝光，以蛋白条带在过曝前显色最深为宜，保存图片，并进行统计分析。

该实验操作步骤解说仅供参考。本人保留一切权利。