低拷贝质粒（pBAC）的提取步骤

200ml菌液一般能提15-20ug质粒。以200ml菌液为例提取低拷贝BAC质粒。(500ml离心管，50ml离心管，普通质粒大提试剂盒Omega，4℃大离心机>15000g/min)

1. 集菌：200ml LB培养基37℃过夜摇菌，6000g/10min集菌（500ml离心管），弃上清。

2. 重悬：用9ml solution I(+RNase)重悬沉淀（无颗粒即可），放2min。（沉淀过多，则可适当加点solution I，后面II/III按比例添加即可，可都在50ml离心管中进行）。

3. 加入9ml solution II，颠倒混匀，静置1-3min，变透亮。

4. 加入12ml solution III，颠倒混匀，静置1-3min。

5. 12000-15000g/30min，取上清至50ml离心管（有残留物则重复离心一次）。

6. 上清加入0.7倍体积异丙醇（即若上清30ml, 则加入21ml异丙醇）充分混匀，可见溶液明显变白色.10000-15000g/30min(大离心机)。轻轻将上清倾倒掉，可用纸巾将管壁异丙醇擦净（避免擦掉DNA沉淀）。

7. 加入500ul Elution Buffer溶解DNA沉淀。

8. 将上述500ul DNA小提去内毒素即可（见以下步骤）

（1）500ul分两管，各加250ul Solution I(+RNase)，使用移液器吹打完全混匀，将重悬的液体转移至1.5mlEP管中

（2）各加250ul Solution II，轻柔上下颠倒混匀数次直至液体澄清，静置孵育2-3min

（3）各加125ul N3(预冷)，轻柔上下颠倒混匀数次直至出现絮状白色沉淀(若加入N3则按小提去内毒素方法即可用于质粒转染；若按普通提质粒法，则建议用氯仿、异丙醇/乙醇纯化)

（4）13000r常温离心10min以上，可见管底有白色沉淀（可能需要两次）

（5）将上清转移至新的1.5mlEP管，估算上清体积

（6）加入0.1倍体积的ETR buffer,上下颠倒10次充分混匀

（7）冰上孵育10min，期间颠倒混匀数次

（8）42°C水浴5min，液体浑浊

（9）25°C 12000r离心3min,ETR在底部分层为蓝色

（10）将上清转移至一个新的2mlEP管中，加入0.5倍体积无水乙醇。轻柔颠倒6-7次，常温静置1-2min

（11）将胶回收柱子放在2ml收集管中，加入700ul第10步的液体到柱子中，12000rpm离心1min，弃掉液体

（12）重复11

（13）加入500ul HBC Buffer（HBC Buffer使用前用异丙醇稀释）

（14）离心，弃掉液体

（15）加入700ul DNA Wash Buffer（DNA Wash Buffer使用前加入无水乙醇）

（16）离心，弃掉液体

（17）重复15-16步骤

（18）离心2min，转移至1.5ml EP管，烘干。

（19）加入80-100ul Elution Buffer，常温静置1min，12000r离心1min获得质粒DNA。