提取RNA常见误解-杭州昊鑫生物

常见误解（之一）

误认为RNA提取一定要4度离心。离心柱提取，上离心柱也用4度离心。其实这是不对的。4度离心只有坏处，没有好处。

常见误解（之二）

误认为提取RNA/DNA不用跑电泳，只要测OD吸光值/OD比值就可以知道浓度和纯度。核酸纯化，大家最大的误解，就以为测出来OD值吸光值就是测出来了核酸的浓度，这个概念是不对的。测OD值，只是测总吸光值，它不能等同于测的是真实核酸浓度。总吸光值可以来源于真正的核酸，也包含来源于残留的杂质，残留的蛋白，残留的降解的RNA/DNA，它们都有吸光值，所以测量的总吸光值OD值换算的浓度，不代表这都是纯核酸的浓度，也可能包含了来源于残留的杂质，降解的RNA，残留的蛋白等等的吸光值换算的浓度。这当然不是真正的纯核酸的浓度。只有在我们提供的核酸(RNA,DNA)是100%纯的时候，测量的OD值浓度才是真正能100%换算成核酸浓度。 举个例子，我们有一个完全降解的RNA，去测量OD值吸光值，它的吸光值也会很高，机器把吸光值换算成的浓度很高，但是这个我们能用吗？RNA已经完全降解了，跑电泳什么也没有。 再举个例子，我们提取DNA完全失败了（完全没有提取到DNA），但是里面残留了一堆的蛋白杂质和降解的RNA片段,我们去测量吸光值OD值，也非常的高，机器换算成浓度也非常高。但是我们能说成功提取了DNA吗？ 跑电泳一看，什么DNA条带也没有，只有前面残留一堆降解的RNA片段。

常见误解（之三）

误认为纯的RNAOD260/280比值是1.8-2.1 或者误认纯的RNA比值是1.8-2.1， 超过2.0或者2.1就降解了。这是完全误解了， 纯的RNA的OD260/280比值是2.2，比值2.1-2.2不但不一定是降解，反而可能是纯度高的标志。 只有超过2.3才提示降解（是否真正降解必须通过电泳来确

艾德莱谈提取RNA常见误解（之四）：

误认为RNA的OD260/230比值偏低，甚至很低的RNA质量不行，无法用于下游实验。这个是一个非常流行的误解，也是危害最大的误解。真相是：OD260/230偏低，大部分是因为提取RNA试剂用到的异硫氰酸胍的残留导致了OD230吸光值升高从而导致OD260/230偏低，但是这种残留的微量异硫氰酸胍在绝大部分情况下完全不影响下游的反转录/荧光定量/测序建库等实验。实验证明，即使残留0.1mM的异硫氰酸胍，也足够被分光光度计检测出来（导致OD260/230测量比值大幅度降低）。但是即使残留100mM 异硫氰酸胍（比机器能测量出来的浓度高1000倍的残留），也不会抑制下游的反转录荧光定量PCR。而实践中，残留异硫氰酸胍达到100mM的情况基本不可能，即使真出现了这种极端高的残留，也不影响下游反转录荧光定量。所以OD260/230比值低，根本不能用于判断RNA的质量好坏，不能用来判断是否可以用于下游实验。打个通俗的比方，一切的致癌物，脱离剂量去谈致癌性都是耍流氓。乙醇是世界卫生组织广而告之的标准的I类致癌物， 同样的甲醛也是I类致癌物，所有啤酒里面都有甲醛，但是你照样会喝酒和喝啤酒。 因为你知道，极少微量的乙醇或者微量的甲醛并不致癌。问题就在这里，RNA提取常用到的异硫氰酸胍往往都会在提取的RNA里面有微量残留，因为分光光度计极其灵敏，非常低的残留就能导致OD260/230比值偏低从而被机器检测出来。但是这个极其微量的残留，完全不影响RNA用于下游的反转录荧光定量，不影响用于下游的测序建库啊。你喝酒的时候知道脱离剂量谈致癌是耍流氓，为啥你提取RNA的时候，脱离残留的剂量去耍流氓说这个RNA不行，不能用呢？？？