基因工程—PCR技术~有点难？【选必三】|0基础救星！
喵喵 | 3-2 基因工程—PCR技术
1️⃣PCR定义及原理
- PCR的原理（polymerase chain reaction）
PCR技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也称聚合酶链式反应，原理为DNA的半保留复制。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内的DNA复制类似。
- 多起点
- 双向复制
- 边解旋边复制
- 半保留复制
2️⃣PCR的条件及过程
- 条件
（1）模板：DNA母链
（2）原料：4种脱氧核苷酸
（3）引物：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
①长度通常为20-30个脱氧核苷酸
②引物自身不应存在互补序列而引起自身折叠，引物之间不应存在互补序列
③PCR反应中有两种引物
（4）耐高温的聚合酶（Taq DNA聚合酶)︰催化合成DNA子链。
（5）缓冲液、Mg²⁺：提供PCR反应合适的酸碱度与某些离子；Taq酶的活性需要Mg²⁺。
2. 过程
PCR的过程包含变性、复性和延伸三个阶段。
变性：90℃以上
复性：50℃左右
延伸：72℃左右
【提问】
是否需要知道目的基因的全部序列？
- 否，只知道这两段即可
想获取目的基因至少进行几个循环？
- 3个循环
3. PCR结果
使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。
理论上1个DNA分子扩增n个循环的DNA数为2ⁿ，只含引物1和只含引物2的DNA分子一共所占的比例是2/2ⁿ.
例题1
实验室内模拟生物体DNA复制时，不需要的条件是
①酶
②游离的脱氧核苷酸
③游离的核糖核苷酸【不合成RNA】
④氨基酸【不合成蛋白质】
⑤DNA分子
⑥能量
⑦适宜的温度
⑧适宜的酸碱度
A. ①②③④⑤⑥
B. ②③⑤⑥
C. ③④⑦⑧
D. ③④✓
例题2
PCR技术的操作步骤依次是
A. 高温变性、中温延伸、低温复性
B. 高温变性、低温复性、中温延伸✓
C. 中温延伸、高温变性、低温复性
D. 中温延伸、低温复性、高温变性
3️⃣PCR扩增产物的电泳检测
- 方法及原理
（1）方法：琼脂糖凝胶电泳
（2）原理：
①DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下会向正极泳动。DNA分子质量越小，迁移速率越快。
②凝胶中的DNA分子可通过核酸染料染色被检测出来。如核酸染料溴化乙锭（EB）
2. 材料及过程
（1）材料用具：电泳装置（包括电泳仪、电泳槽、制胶槽、梳子等）、微量移液器、紫外检测仪、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
（2）过程：配胶→点样→电泳→检测
3. 电泳图分析
（1）Marker (M)︰标准样，一个已知分子质量的DNA样品，作为对照，
用来确定待测样品中DNA的相对分子质量。
（2）DNA荧光条带：
①条带的有无：代表是否成功扩增出待测样品中的DNA。
- 若无条带，常见原因有：无DNA模板，引物设计不合适。
②条带的亮度：代表扩增的DNA数量，越亮代表DNA数量越多
③条带的位置：常代表DNA的大小。一般距离点样孔越远，说明跑的越快，DNA的分子质量越小。
4. PCR的应用
广泛应用于基因工程目的基因的获取、遗传病的诊断、刑侦破案和DNA序列测定等。
例题3
琼脂糖凝胶电泳是检测核酸长度常用的方法，在某次实验中，得到如下的结果，请根据图像选择说法不合理的是
A. B端是电泳的起始端【A端，从大到小】
B. 核酸的电泳速度与其片段大小成负相关关系
C. 1 号样品为Marker组，用于标定其他组核酸片段的大小
D. 2，3，4号样品中均只含有一种DNA分子【4有两种】
