弓形虫能造就狼群首领？？？寄生虫感染增加了社会性食肉动物中间宿主的风险承担能力

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种能够感染任何恒温动物的原生动物寄生虫，能够增加中间宿主的冒险行为。尽管实验室对弓形虫感染对行为的影响进行了广泛的研究，但对弓形虫病对野生中间宿主行为的影响了解甚少。美国怀俄明州黄石国家公园有一个多样化的食肉动物群落，包括灰狼（Canis lupus）和美洲狮（Puma concolor），它们分别是淋病的中间和最终宿主。在这里，我们用26年的狼的行为、空间和血清学数据表明，狼的领地与美洲狮密度高的地区重叠是感染的一个重要预测因素。此外，血清阳性的狼更有可能做出高风险的决定，如扩散和成为狼群的领导者，这两个因素对个体的健康和狼的生命力都很关键。由于狼群中的社会等级制度，我们假设弓形虫病的行为影响可能会产生一个反馈回路，增加狼和美洲狮之间的空间重叠和疾病传播。这些发现表明，寄生虫通过行为影响对中间宿主有重要影响，而不是急性感染。特别是在社会性物种中，这些影响可以超越个体，影响动物群体、种群，甚至生态系统过程。

简介

弓形虫是一种无处不在的多宿主原生动物寄生虫，能够感染任何恒温动物，需要猫科动物的明确宿主来进行性繁殖。感染通过以下方式传播：摄取最终宿主在环境中脱落的卵囊（例如，通过水或植被的环境介导传播），摄取最终宿主或中间宿主的受感染组织囊，或者，如果胎儿感染后存活，通过先天性传播垂直传播。

一旦中间宿主被暴露，感染就会从肠道内壁扩散到大脑和肌肉组织中形成囊肿，发生急性弓形虫病。如果急性感染发生在怀孕期间，可导致分娩并发症、自然流产和死胎；对于年轻或免疫功能不全的个体，可引起致命的脑炎。免疫功能正常的个体一般不表现出临床症状，但由于囊肿的存在，会有慢性终身感染。实验研究表明，慢性感染，即使在健康个体身上，也会导致多巴胺和睾丸激素分泌增加。这些激素的变化可以导致攻击性和冒险行为的增加，如增加过度活跃的运动，不能避免嗅觉捕食者踪迹（即寻找而不是避免猫科动物的尿液），以及减少恐新症。

考虑到弓形虫感染对中间宿主的繁殖和行为的影响，弓形虫在野生生态系统过程中的作用还没有被充分研究。Gering等人（2021年）是为数不多的关注感染对野生哺乳动物行为影响的研究之一，他们发现弓形虫病与斑鬣狗（Crocuta crocuta）幼崽的胆量增加有关，所有年龄段的血清阳性斑鬣狗都更有可能被非洲狮（Panthera leo）杀死。该研究表明，弓形虫病与个体的健康状况之间通过行为和决策存在机制上的联系。

黄石国家公园（YNP）的灰狼（Canis lupus）是几十年来广泛研究的对象，主要集中在捕食者-猎物动态、种群动态、遗传学、行为和犬类病原体。YNP是一个复杂的多种肉食动物生态系统，由于景观的高度异质性和猎物的移动，狼和一个明确的弓形虫宿主美洲狮（Puma concolor）在分布空间上重叠。因此，在北美生态系统中，狼和美洲狮之间可能存在类似于斑鬣狗和狮子之间的多物种弓形虫传播途径，在分布空间上与美洲狮重叠的狼可能通过与美洲狮的直接或间接接触增加弓形虫传播风险。弓形虫已被记录在YNP灰狼体内，我们试图通过26年的灰狼血清学和观察数据来了解弓形虫在这种社会性、中间宿主食肉动物中的作用。

我们的第一个目标是确定哪些种群统计学和生态学因素会影响黄石公园狼群的弓形虫病感染。我们测试了个体种群统计学因素，包括年龄、性别、捕获时的社会地位和毛色，因为它们在疾病易感性方面有潜在的变化。以前的研究发现，由于暴露的风险随着时间的推移不断积累，弓形虫感染的风险随着年龄的增长而增加。其他三个狼的种群统计学因素被包括在内，因为它们与某些激素有联系，而这些激素可能影响动物的感染易感性。性激素在感染风险中起作用，一旦被感染，激素分泌可能会改变；然而，其他研究发现，弓形虫血清流行率和性别之间没有联系。由于两性之间激素水平（睾酮、孕酮、雌激素等）的自然变化，可能存在不同的风险和随后对感染的行为反应。以前的研究发现，社会地位（如狼群首领）和毛色（灰色毛色的狼有较高的皮质醇水平和增加的行为攻击性）与不同的激素水平和免疫防御有关。为了确定血清流行率是否受到与弓形虫明确宿主（即美洲狮）的空间重叠量的影响，我们为每个狼和美洲狮密度高的地区列入了一个重叠指数。

我们的第二个目标是确定弓形虫感染是否影响狼的行为。我们确定了三种与更大的风险承担有关的狼的行为：（1）离开狼群进行扩散，（2）取得主导的社会地位（被称为成为狼群首领），（3）接近人或车辆（被称为习惯化），以及与风险增加有关的两种死亡原因：（a）种内死亡（即通过狼群之间的战斗被其他狼杀死），或（b）人为的死亡（即由于减少对人类或人类事物的接近而被人类杀死）。由于行为会受到许多因素的影响，我们在每个行为模型中都控制了某些变量：性别会影响诸如扩散等行为，而年龄会影响某种行为发生的概率。黄石公园北部的狼密度非常高，道路全年开放，海拔较低，为有蹄类动物提供了冬季草场，也为公园边界外的猎狼人提供了机会。所有这些因素都可能影响狼的行为，因为那里的狼可能有更多的机会扩散，死亡，并可能更容易习惯化。因此，我们也控制了黄石公园系统（北部或不在北部）。在控制这些可能影响狼行为的因素时，我们的目的是分离出弓形虫感染对行为的影响。我们测试了血清状态是否影响了狼做出这些行为或死于这些原因之一的几率。我们讨论了我们两个目标的发现，即影响弓形虫血清流行的因素和确定弓形虫病是否影响狼的行为，涉及到种间疾病的动态以及行为变化如何在多种规模上影响灰狼。

在这里，我们发现，狼群中的弓形虫感染是由狼群与明确的宿主美洲狮的重叠所预测的，而且弓形虫血清阳性的狼改变了它们的行为以承担更大的风险--它们比血清阴性的狼更有可能扩散并成为狼群领袖。由于狼群的社会结构，这些行为的变化可能会引起一个反馈回路，导致狼群层面的冒险行为增加，对疾病的进一步传播以及与美洲狮的种间竞争和狼的生存有重要影响。

结果

血清学：在62只美洲狮中，51.6%的个体血清反应呈阳性。美洲狮的血清流行率从第一次采样时间（n = 47，1999年至2004年）的45%上升到第二次采样时间（n = 15，2016年至2020年）的73%。这项测试证实了弓形虫在黄石公园最丰富的确定宿主中的存在。

1995年至2020年期间，每年平均收集11.8份血清样本（范围=4-22），以测试弓形虫抗体。从1995年到1999年的50次测试都是阴性的，然后在2000年有三只狼的血清测试是阳性的。此后，每年都有1至8只狼血清呈阳性。使用ELISA检测出17个不明确的样本，然后使用MAT检测法重新运行，这使我们能够区分出11个血清阳性和6个血清阴性的样本。1995至2000年的血清流行率为0.0%，2000至2004年为24.5%，2005至2009年为18.7%，2010至2014年为42.9%，2015至2020年为36.5%。利用2000年至2020年收集的样本，我们对256个样本进行了273次测试。患病率为27.1%（n = 74），其中61.9%为阴性（n = 169），11.0%为不明确（n = 30）。25个个体由于多次被捕获而在一生中被检测了不止一次，因此有多个样本，间隔至少11个月。8只雄性被检测了两次，15只雌性被检测了两次，2只雌性被检测了三次。考虑到多次检测，共测试了229个个体：116只雄性，112只雌性，以及一个雌雄同体。雌性（31.25%）的血清流行率略高雄性（25.00%），但这些比例没有差异（z-score=

-1.05, p = 0.15). 狼的年龄被记录为连续变量和分类变量，有100只幼狼、53只一岁狼、88只成年狼（2.0-5.9岁）和15只老年狼（6.0岁及以上）。三个年轻类别之间的血清流行率相似（幼崽=29.00%，一岁幼崽=28.30%，成体=26.14%），只有老年狼（46.67%）有所增加。将幼崽血清流行率与所有其他年龄组进行比较的测试并不显著（z-core=0.346，p=0.36）。最大的差异是老年狼和所有其他年龄组的集合（z-score=-1.40，p=0.08）。我们还测试了灰色和黑色被毛颜色之间的弓形虫暴露差异，发现没有差异：灰狼（n = 115）有25.22%，黑狼（n = 114）有31.58%血清阳性（z-score = -1.07，p = 0.14）。同样，我们测试了采样时的社会地位，发现没有差异：下属（n=197）有30.45%，领导（n=59）有23.73%的血清阳性率。与美洲狮密度≥1.8/100km2（HCO）的狼有至少42.1%的重叠，其血清阳性比例高于MCO的狼（5.1-42.0%），这比LCO的狼（0～5%的重叠）要高。12只患有LCO的狼（n=83，14.46%）为阳性，30头患有MCO的狼（n=83，36.14%）为阳性，31头患有HCO的狼（n=84，36.90%）为阳性。在集合的MCO和HCO中，血清阳性狼的比例大于LCO的狼（Z-score = -3.65, p = <0.001). 为了直观地了解美洲狮的密度和与不同狼群领地的重叠情况，我们汇集了九个一般狼群使用区的血清阳性测试，并将其绘制在黄石公园的地图上，突出强调了美洲狮的高密度（图1）。

种群统计学分析结果：检验血清阳性概率的完整模型，wi = 0.99，包括性别、年龄、社会地位、被毛颜色和COUGAR OVERLAP指数（表1）。NULL模型表现很差，wi = 0.01。

COUGAR OVERLAP指数（β=1.089，95%CIs：0.176-2.003）是影响狼对冈底斯氏菌血清阳性的重要因素。从LCO到MCO再到HCO的增加与较高的检测阳性的可能性有关。COUGAR OVERLAP的几率是2.97（exp[1.089]），这意味着MCO狼血清阳性的几率比LCO狼高近三倍。HCO狼血清阳性的几率比LCO狼血清阳性的几率几乎高9倍。基于完整模型的血清阳性预测概率（图2）显示，血清阳性率随着美洲狮的重叠而非线性增加：生活在LCO地区的狼的预测流行率为4.7%，而生活在MCO的狼的预测流行率为12.5%，生活在HCO的狼的预测流行率为28.4%。

意外的是，AGE对弓形虫感染没有影响（β=0.296，95%CIs：-0.158-0.751），95%置信区间重叠为零。完整的模型包括SEX，但这个变量不显著，置信区间为零（β=0.769，95%CIs：-0.4984-2.022）。测试时的社会地位不显著（β=-0.836，95%CIs:-1.982-0.311），大衣颜色也不显著（β=0.516，95%CIs:-0.726-1.757）。

行为分析结果：被归类为扩散狼的弓形虫血清流行率几乎是非扩散者的两倍。分散者为36.26%，非扩散者为18.42%（z- score=3.11 p < 0.001）。包括TOXO的模型（DISP1）比没有TOXO的模型（DISP2）表现更好（wi=0.92；表2）。所有四个变量都是显著的，P值<0.05，没有一个置信区间与零重叠。雄性狼比雌性狼更有可能扩散，生活在黄石公园北部的狼比黄石公园内部的狼更有可能扩散，随着监测时间的增加，狼更有可能扩散，血清阳性狼比血清阴性狼更有可能扩散（β = 2.459，95% CIs: 0.298-4.620）。TOXO的几率为11.69（exp[2.459]），这意味着血清阳性狼扩散的几率比血清阴性狼扩散的几率高11倍。

使用表现最好的模型来预测扩散情况，我们发现血清阳性的雄狼最可能散布，其次是血清阴性的雄狼，血清阳性的雌狼，然后是血清阴性的雌狼（图3）。这一结果证实了以前报道的黄石公园狼的性别扩散证据，并表明弓形虫感染影响了两种性别的扩散决定。血清阳性的雄性在监测到6个月时有50%的可能会扩散，血清阴性的雄性在监测到21个月时有50%的可能会扩散。血清阳性的雌性在监测到30个月时有25%的扩散概率，而血清阴性的雌性在48个月时达到相同概率。这些差异（雄性15个月达到50%的扩散率，雌性18个月达到25%的扩散率）表明血清阳性狼的扩散率要比血清阴性狼高很多。

血清阳性狼比血清阴性狼更有可能成为狼群领袖（z = 4.1705，p < 0.001）。包括TOXO的模型（LEAD1）比没有TOXO的模型（LEAD2）表现更好（wi = 1.0，表3），SYSTEM是唯一一个重合于零的变量。TOXO的影响是正的，置信区间刚刚达到零（β=3.83，95%CIs：-0.004-7.664）。赔率为46.06（exp[3.83]），血清阳性狼成为狼群领袖的几率比血清阴性狼成为狼群领袖的几率高46倍以上。

使用表现最好的模型来预测领导力，我们绘制了带有和不带有弓形虫的狼成为首领的概率，发现血清阳性的狼比血清阴性的狼更有可能成为首领，这种影响随着监测时间的增加而增加（图4）。

弓形虫染并不能解释习惯性行为（z = 1.604, p = 0.055），尽管这个样本量非常小，只有27只狼被归类为习惯性行为，其中只有4只血清阳性（13.79%）。没有TOXO的模型（HAB2; wi =0.69）比有TOXO的模型（HAB1）表现更好。这种行为测量是非常过程的，而且受到样本量的限制。

我们测试了不同死因的狼的弓形虫血清流行率的差异，通过几个比例的比较发现没有差异：人类造成的（n = 56，32.14% T. gondii阳性）与自然造成的（n = 99；31.31%）没有差异（z = 0.107，p = 0.456）。狼造成的（n = 63，31.75%）与任何其他已知原因（n = 137；33.78%）没有区别（z = 0.253，p = 0.401）。狼造成的死亡与已知的（非狼）自然死亡（n = 81; 38.90%）没有差异（z = -0.567, p = 0.284）。对于通过GLMMs检查的两种死因，没有TOXO的模型比包括TOXO的模型（INTRA-MORT2：wi = 0.72和ANTHRO-MORT2：wi = 0.75）表现得更好（INTRA-MORT1和ANTHRO-MORT1）。

讨论

这项研究提供了对野外生态系统中寄生虫感染和中间宿主行为之间关系的深入了解。寄生虫弓形虫的感染与啮齿动物、黑猩猩（Pan troglodytes）、鬣狗以及现在的灰狼的冒险行为增加有关。狼的领地与美洲狮的重叠是弓形虫感染的一个主要生态预测因素，而狼的种群统计学（如性别或年龄）并不具有参考价值。淋病血清阳性影响了我们测试的三种风险行为中的两种：血清阳性的狼比血清阴性的狼更容易扩散和成为狼群领袖（图5）。这些结果不仅支持以往的实验室研究，也支持最近关于鬣狗的研究，证实弓形虫病可以影响野生中间宿主物种的行为和决策。

狼和美洲狮是在北美洲同时演化的竞争对手。这两种食肉动物通常捕食相同的物种，然而种间冲突通过分离在时间和空间生态位，以及主动回避对方来缓解。我们的研究证实了Gering等人（2021）的研究结果，即寄生虫传播是同域食肉动物之间动态的一个重要因素。

由于与美洲狮的分布重叠对灰狼弓形虫血清流行率的影响很大，狼可能是通过直接接触受感染的美洲狮或其脱落的卵囊而感染寄生虫，而不是通过食用其他中间宿主物种。黄石公园的大型有蹄类动物季节性地迁移到公园的所有区域，与所有取样的狼群领地重叠。如果这些有蹄类动物具有较高的弓形虫血清流行率，我们将可能记录所有狼群具有类似的血清流行率水平。马鹿是狼在黄石国家公园的主要猎物，已经进行了弓形虫的测试（n = 155），没有一个是明确的血清阳性，只有5个（3.2%）是怀疑的血清阳性（未发表的数据，黄石资源野生动物健康中心）。

在冬季，黄石国家公园的迁徙的有蹄类动物向低海拔地区移动，由于狼和美洲狮都在捕食有蹄类动物，这随后增加了这两种捕食者之间的分布重叠。这种重叠的增加发生在狼的繁殖、孕育和产仔季节（2月至6月20日），从隆冬到初春。假设狼在这段时间更有可能接触到弓形虫，那么就有可能对它们的繁殖产生负面影响。具体来说，弓形虫病可引起胚胎和胎儿发育的并发症，并导致胎儿或新生儿死亡，这一点在家犬身上得到证实。此外，在这个时期（冬季狼的繁殖季节），狼与狼之间的传播可能是可能的，因为在急性感染期间，弓形虫病可以在犬类物种中进行性传播。

与以前的弓形虫野生动物研究（包括狼）一致，性别不是预测淋病感染的一个重要因素。与其他研究相反，模型结果显示，狼的感染并不随年龄变化。这些影响可能被暴露的空间差异所掩盖，即生活在有许多美洲狮的地区的年轻狼比生活在有少量美洲狮重叠的地区多年的老狼有更高的感染风险。

这项研究是首次研究弓形虫感染与狼的行为和决策之间的关系，发现寄生虫感染和狼的生态学之间的联系。扩散是狼群动态的一个重要功能，但也代表着一个危险的决定，因为那些离群扩散的狼会遭受更高的死亡率。然而，如果一个个体在扩散过程中幸存下来，它们往往会发现繁殖的机会增加。由于血清阳性的狼更有可能扩散，这就为患有弓形虫病的狼提供了一种潜力，可以去占领未被其他狼占领的领地或试图在新的地区建立种群。

此外，与血清阴性的狼相比，血清阳性的狼成为狼群领导者的可能性几乎是两倍。患有弓形虫可能会增加睾丸激素水平，导致攻击性增强和优先性选择（正如在大鼠[Rattus norvegicus]中发现的那样）。如果血清阳性的狼在狼群内部的互动中更具攻击性，它们可能更容易成为狼群的领导者。攻击性和支配力的增加，加上可能的优先性选择，可能解释了弓形虫病和领导力之间的机制。最终，获得支配性的领导地位对于通过生殖成功来提高体质是至关重要的，而且据推测是在强烈的选择之下。

由于狼群的群居结构，狼群首领对其狼群伙伴和群体决策有着不成比例的影响（图6）。如果头狼感染了弓形虫并表现出行为上的变化（如寻找猫科动物的气味或新的环境，如老鼠或黑猩猩），这可能会产生一种动态，即由一只狼的寄生虫引发的行为会影响狼群中的其他狼。如果狼群首领寻找猫科动物的气味，这可能会增加其他未受感染的个体在环境中遇到受感染的美洲狮或其脱落的弓形虫卵囊的可能性，然后也会被感染。如果宿主被猫科动物杀死并吞食，寻找猫科动物气味的中间宿主有助于使寄生虫完成其生命周期。此外，通过社会学习，狼群首领的行为（即寻求更多的风险）可能会被未受感染的个体所观察和模仿，从而创造出一种更自信、更敢冒险的狼群文化，即使只有少数关键个体实际受到感染。这两种途径都可以通过增加空间重叠，甚至与美洲狮的直接互动来增加狼的弓形虫感染。

几乎可以肯定的是，在演化过程中会有一些限制来缓和这种反馈循环。怀孕期间的急性感染会导致胎儿死亡。这方面的急性感染会严重降低繁殖成功率，对受感染的个体在演化上是不利的。此外，狼因几乎没有风险的事情而死亡是很罕见的。在黄石国家公园，狼死亡的三个主要原因是种内争斗、人为因素（如被人类猎杀、被车辆撞击）和捕食大型猎物时的受到致命伤害。如果受感染的狼（或那些从受感染的领导者那里学到的）承担更大的风险，那么它们的生存率很可能会低于那些避免风险的狼。这种假设的弓形虫-美洲狮-狼-行为的反馈回路取决于导致演化优势的风险（如领导力和增加繁殖机会）和导致过早死亡的风险之间的平衡。无论如何，淋病感染的影响显然超出了我们在这项研究中的发现，对灰狼的生存和繁殖以及种间竞争和疾病动态产生了影响。

这项研究是一个罕见的关于寄生虫感染影响野生哺乳动物群体行为的证明。我们发现，在弓形虫血清阳性的狼中，扩散和成为狼群领袖的几率大幅增加，这两种行为都很危险。这两种生活史行为是狼一生中最重要的决定，可能会对狼的体质、扩散和生命率产生巨大的影响。扩散的狼经常探索新的栖息地，是扩大当前狼分布范围的个体。活下来建立领地的扩散者往往会获得繁殖的位置。狼群首领是最有可能繁殖的个体，这对种群增长率有重要影响，也可能影响狼群行为和文化。此外，我们的研究结果表明，狼直接从美洲狮或其脱落的卵囊中感染弓形虫，而不是通过中间宿主。这项研究表明了社区层面的互动如何影响个体行为，并有可能扩展到群体层面的决策、种群生物学和群落生态学。将寄生虫感染的影响纳入未来的野生动物研究，对于理解寄生虫对个体、群体、种群和生态系统过程的影响至关重要。