非靶向代谢组学 | 淋巴系统竟然帮癌细胞转移提供更高的生存能力

表2∣人和小鼠黑色素瘤的表征

注入淋巴后形成肿瘤的细胞比例要高于静脉注射；与静脉注射相比，通过淋巴注射会产生更远的转移，即淋巴中的癌细胞存活率增加，形成转移瘤的机会将更高（图1）。血液中的黑色素瘤受到的氧化应激较比淋巴中更强，因此淋巴中黑色素瘤存活率更高。流式细胞技术分离出的血液和淋巴中的黑色素瘤细胞，通过生物发光图像可以量化内脏器官的转移性疾病负担（图2）。

图1 | 与血液相比，淋巴中的黑色素瘤细胞受到的氧化应激作用更少

图2 | 流式细胞术可从血液和淋巴中分离出黑色素瘤细胞，生物发光图像可以量化内脏器官的转移性疾病负担

黑色素瘤在血液中发生铁死亡

通过皮下注射将人和小鼠黑色素瘤分别移植到NSG和C57BL小鼠中，使其自发转移。相比皮下或淋巴，大多数人和小鼠血液中的黑色素瘤细胞明显表现出更高的脂质ROS水平。铁可促进脂质ROS的生成，是铁诱导细胞死亡所必须的因素。血浆中的游离铁浓度比淋巴液中高得多（图3）。

图3 | 与淋巴相比，血液中黑色素瘤受铁死亡影响的细胞增加

为确定铁死亡是否会限制血液中黑色素瘤细胞的存活，用liproxstatin-1预处理黑色素瘤细胞，然后移植到小鼠静脉中。liproxstatin-1预处理在有效转移人和小鼠（图3f/g）的黑色素瘤中显著增加转移性疾病负担，经过同样预处理的无效转移黑色素瘤转移性疾病负担没有明显增加（图4）。

图4 | liproxstatin-1对皮下肿瘤生长的影响以及其他抑制剂对转移的影响

测试铁死亡的重要性，从两种小鼠黑色素瘤中敲除了谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)的基因。体内缺乏Gpx4显著增加皮下肿瘤中脂质ROS的水平；显著降低血液中黑色素瘤细胞（图5）。

图5 | Gpx4缺失对小鼠黑色素瘤存活和增殖的影响

油酸可以预防铁死亡

采用非靶向代谢组学的方法，分析从同只小鼠血液、淋巴中分离出的细胞，表明淋巴与血液中的黑色素瘤细胞各自聚集在一起（图6a）。分析富集的代谢产物，发现排名前五的途径中有三种与脂质代谢有关（图6b）。磷脂的脂肪酸组成影响癌细胞对铁死亡的敏感性，鉴定出的57种脂质中，淋巴瘤和血液黑色素瘤细胞之间油酸差异最大；油酸在淋巴和血液中含量较高，并在淋巴黑色素瘤细胞中富集（表3、图7）。

图6 | 淋巴和淋巴中黑色素瘤细胞的油酸水平较高，油酸可预防铁死亡

表3 | 质谱分析的脂质种类清单

图7 | 血浆和淋巴中的脂质种类

脂质组学分析发现，游离油酸的含量很低，无法得出显著差异，但淋巴中三酰甘油和磷脂中的油酸总量要高于血液，且淋巴的油酸主要存在于三酰甘油中，血浆的油酸主要存在于磷脂中。而实验证明，油酸以ACSL3依赖的方式阻断黑色素瘤细胞的铁死亡（图8）。大多数黑色素瘤经过油酸处理后会形成更多的转移灶。细胞可通过降低氧化应激提高随后血液迁移过程中的细胞存活率，来保护转移细胞免于铁死亡，这可能是黑色素瘤免受淋巴中氧化应激的主要原因（图9）。

图8 | ACSL3对油酸结合磷脂及油酸对铁死亡的保护是必需的

图9 | 黑色素瘤细胞中潜在铁死亡调节剂的表达

相关讨论

1. 血液中的细胞比皮下肿瘤或淋巴中的细胞表现出明显更高的脂质ROS水平。用erastin和/或Liproxstatin-1进行培养，erastin通过抑制胱氨酸摄取来促进铁死亡，Liproxstatin-1通过减少脂质过氧化物的积累来抑制铁死亡。

2. 黑色素瘤细胞在淋巴中是否比血液中经历了更少的氧化应激。将人和小鼠黑色素瘤细胞移植到NSG或C57BL小鼠皮下，并允许其自发转移。同一小鼠皮下肿瘤、淋巴和血液中的黑色素瘤细胞用CellROX DeepRed染色，它检测活性氧物种(ROS)，包括羟自由基。对于免疫受损小鼠的患者来源的异种移植和免疫功能正常小鼠的小鼠黑色素瘤，黑色素瘤细胞在血液中的ROS水平一直明显高于皮下肿瘤和淋巴中的ROS水平。细胞分离后用还原剂2-巯基乙醇处理，很大程度上挽救了活性氧水平的增加。因此，黑色素瘤细胞扩散到血液中与活性氧显著增加有关，而扩散到淋巴中则没有。

3. 黑色素瘤细胞在血液中发生铁死亡，而在淋巴中不发生。两者间最大差异是油酸。油酸是一种单不饱和脂肪酸，淋巴比血液中含量丰富，它通过减少膜上可供氧化的多不饱和脂肪酸的数量或密度来抑制培养物中的铁死亡。

4. 遗传学上测试铁死亡的重要性，使用CRISPR-Cas9从小鼠黑色素瘤中删除编码谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)的基因，Gpx4通过减少脂质ROS的积累来抑制铁死亡，铁死亡限制了血液中黑色素瘤细胞的生存。Gpx4的缺失并未显著影响在生理氧水平下培养的小鼠黑色素瘤细胞的增殖或存活，但确实降低了在大气氧水平下培养的黑色素瘤细胞的存活或增殖，表明随着氧化应激的增加，GPX4在黑色素瘤细胞中变得更为重要。

研究讨论

淋巴中的黑色素瘤细胞比血液中经历较少的氧化应激，并能形成远处转移，提高黑色素瘤细胞的存活率。淋巴中的黑色素瘤细胞对铁死亡更有抵抗力，并能形成更多转移。与血浆相比，淋巴液中油酸和谷胱甘肽水平升高、淋巴中游离铁减少，可能导致氧化应激和铁死亡的降低。油酸以ACSL3依赖性方式保护黑色素瘤细胞免于铁死亡，增加转移性肿瘤的能力。因此暴露于淋巴可保护黑色素瘤细胞免于铁死亡，并提高它们在血液转移过程中存活的能力。黑色素瘤细胞在血液中发生铁死亡，而在淋巴中不发生，最大的因素是淋巴比血液中的油酸含量丰富，油酸是一种单不饱和脂肪酸，通过减少膜上可供氧化的多不饱和脂肪酸的数量或密度来抑制培养物中的铁死亡。

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小鹿推荐

文章通过非靶向代谢组学及脂质组学等方法，对淋巴系统保护黑色素瘤细胞免于铁死亡而促进转移做了深入研究。研究发现淋巴系统可为黑色素瘤细胞提供更高的油酸，经历更少的氧化应激，为黑色素瘤细胞提供更高的存活率和转移能力。通过文章更深层次的研究，未来对癌细胞的干预研究、淋巴系统与癌细胞的相互关系及新药物的研发机制提供了更有价值的研究思路。

文末看点｜lumingbio

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