间接免疫荧光

一、实验目的

最直观观测到蛋白的表达、在细胞中的定位或迁移、存在状态。

Ø 表达（有光无光）：1）检抗原（病毒）；2）检抗体（单抗的验证）

Ø 定位：膜定位，胞浆定位，核定位，与某个细胞器共定位（ER/MITO）

Ø 迁移：入核现象（磷酸化的p65/IRF3/STAT1等转录因子）

Ø 状态：弥散，聚集形成点状颗粒。（应激颗粒SGs、P小体）

二、实验原理

高度的特异性抗原-抗体免疫学反应。间接免疫荧光是相对直接法而言，耦联有荧光色素的二抗（抗抗体）与抗原抗体复合物结合后，在荧光显微镜下呈现出特异性荧光反应。

荧光素：

1. 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）是应用最广泛的荧光素，最大吸收光波长为490--495nm，最大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，主要优势是人眼对黄绿色较为敏感，主要缺点是易淬灭。

2. 菁类染料-Cyanine dyes：Cy2, Cy3, Cy5

3. Alexa Fluor系列染料:由美国生命技术公司(Life technologies)旗下的分子探针公司（Molecular Probes）开发的系列荧光染料

Alexa Fluor 488——最好的绿色荧光基团（FITC）

Alexa Fluor 594——优于Texas Red的替代品（Texas Red）

Alexa Fluor 647——优于Cy5的替代品（Cy5）

细胞核染料：

1. DAPI: 4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料 ，常用于荧光显微镜观测。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。 DAPI 可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光。（毒： DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。 -20℃避光保存）

2. Hochest：既可以用于活细胞也可以用于固定细胞的蓝色荧光染料。

共定位：一般是针对两个蛋白的亚细胞分布（定位）而言，若两个目的蛋白在胞内位置有重叠，那么至少为两者可能存在相互作用提供了一个必要的空间位置条件，但不是直接证据。

细胞器定位：利用细胞器红荧光探针染料（如Mito Tracker Red）将细胞器位置显现出来，绿色荧光标记目的蛋白。如果目的蛋白与该细胞器存在的位置相同，则红色荧光与绿色荧光叠加形成黄色荧光位点（foci）。

三、实验材料

玻片，镊子，75%酒精，细胞转染用物品，PBS，4%多聚甲醛，甲醇（或Trixon-X-100），摇床，DAPI染色液，甘油，载玻片，激光扫描共聚焦显微镜（Olympus FV10）

四、实验步骤

1. 细胞爬片的处理及接种细胞

实验室购买的细胞爬片是无菌的（NEST，适合24孔板的大小），但是为了进一步避免污染，建议在超净台中取出后用75%酒精浸泡5-10分钟，用镊子夹取后在酒精灯上将爬片上残留的酒精烧干，然后轻轻放入细胞板内，再接入适量消化好的细胞。

若用HEK-293T细胞等贴壁不紧的细胞进行间接免疫实验，可先用多聚赖氨酸预处理爬片，再将消化好的细胞接入孔中。

注意:

Ø 接细胞时控制合适的细胞量，避免收样时细胞量过大影响结果的观察；

Ø 接种细胞前，可事先在孔内滴一滴生长液，这样有利于细胞均匀分布（特别是Hela细胞）；

Ø 接种细胞后，建议不要摇板子；

Ø 由于爬片比较薄，每次在酒精灯上烧的时间都不能太长，不然容易破碎；

Ø 尽量保证每个孔中只有一片爬片（因为爬片很薄，比较容易出现一次取到多片的情况），也一定保证每个所需要的孔中都有爬片（仔细检查，很重要！）。

2. 转染或接毒等

3. 收样

1）PBS洗3次，每次5 min

2）预冷的固定剂室温固定15 min（目前实验室常用：4℃预冷的4%多聚甲醛）

3）PBS洗3次，每次5 min（若用甲醇透化，此步骤可省略）

4）通透剂室温穿孔10 min（目前实验室常用：-20℃预冷的100%甲醇）

5）PBS洗3次，每次5 min（该步骤一定不能省略）

6）封闭液37 ℃封闭30~60 min（或4 ℃过夜）

封闭液可以选用5%山羊血清或BSA（牛血清白蛋白）

7）PBS洗3次，每次5 min（若用封闭液稀释一抗，此步骤可省略）

8）加入一抗（PBS或封闭液稀释，稀释倍数具体看说明书），4 ℃过夜（或37 ℃孵育1 h）

9）PBS洗3次，每次5 min（该步骤一定不能省略）

10）加入荧光二抗（PBS稀释倍数具体看说明书），37 ℃孵育1h

11）DAPI染核，室温15 min

12）PBS洗3次，每次5 min

13）封片、上镜观察（甘油：PBS=1:1配制成50%的甘油用于封片）

Ø 根据实验需要，可以选用Triton X-100作为通透剂：一般配制成30%的Triton X-100储备液，4℃避光保存，用PBS稀释成0.5%的工作浓度；

Ø 若需要孵育两种或三种一抗，可以同时孵育，也可以逐个孵育；逐个孵育时，两个一抗之间PBS洗3次，每次5 min。同时孵育的好处：节约时间；逐个孵育的好处：回收的抗体没有其它抗体的污染；一抗可以回收使用；

Ø 二抗不需要回收使用，多种二抗可以同时孵育；孵育二抗及其之后的所有操作均需要避光；

Ø B座的共聚集显微镜可以同时检测三种不同的荧光（所以可以同时检测三种不同蛋白的定位）；

Ø DAPI有毒！需配戴手套！

Ø 封片时，每个样品适当多滴加封片剂（如20μl），会减少气泡形成的概率;

Ø 封片步骤：

1)  载玻片上做标记后滴一小滴荧光封片液，待用；

2)  将1ml注射器针头弯曲，从孔内钩起玻片，用镊子夹出；

3)  将玻片轻放在载玻片上，细胞面与封片液接触；

 将处理好的玻片置于暗盒中，可以存放一周左右，但最好尽快观察。