“流量密码”铁死亡：从基础特征到检测方法

当2012年Brent R. Stockwell首次提出了铁死亡的概念之后，便开始铁死亡研究热。这期就带你了解什么是铁死亡，一起探索铁死亡的奥秘所在！

一、什么是铁死亡

铁死亡是一种依赖于铁离子的程序性细胞死亡形式，是由于多种因素（如药物或基因因素）造成代谢过程的改变和过氧化脂质的积累，使细胞膜结构受损而引起。

铁死亡有一些不同于其他程序性死亡的特殊细胞形态学特征，例如线粒体变小，线粒体膜密度增高，线粒体嵴减少或消失，线粒体外膜破裂。

铁死亡与神经退行性疾病、癌变、中风、脑出血、创伤性脑损伤、心脏缺血再灌注损伤和哺乳动物肾脏变性有关，也与植物的热应激有关。

二、铁死亡的调控网络

铁死亡的调控主要是铁死亡防御系统和铁死亡执行系统的博弈（图1）。铁死亡执行系统包括PUFA-PL的合成和过氧化，以及铁代谢。由LPCAT3和ACSL4介导的PUFA-PL合成，以及ALOXs和POR介导的PUFA-PL过氧化是铁死亡发生的必要条件。

铁死亡防御系统主要包括GPX4依赖的系统（SLC7A11-GSH-GPX4轴）和GPX4非依赖的系统（如NAD(P)H-FSP1-CoQ10轴和DHFR-BH4-GCH1轴）。

三、铁死亡执行系统

1）PUFA-PL合成与过氧化

ACSL4和LPCAT3促进多不饱和脂肪酸 (PUFA) 掺入磷脂中形成多不饱和脂肪酸的磷脂 (PUFA-PL)。PUFA-PLs 易受脂氧合酶 (ALOXs) 介导的自由基引发的氧化作用。

这种氧化作用最终会导致脂质双层的破坏并影响膜功能，从而促进铁死亡。乙酰辅酶A羧化酶 (ACC) 催化的乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A，这是合成一些 PUFA以及执行铁死亡所必需的。

ACSL4、LPCAT3或ACC的失活或减弱均可阻断铁死亡。因为PUFA中存在双烯丙基部分，PUFA-PL容易发生过氧化作用，这主要由于芬顿反应驱动的非酶促自氧化催化，其中铁充当催化剂。

此外，POR或ALOXs介导的酶促反应也可促进脂质过氧化。单不饱和脂肪酸 (MUFA) 由于缺乏双烯丙基部分而不易过氧化，其通过取代细胞膜中的多不饱和脂肪酸来抑制脂质过氧化和铁死亡。参与MUFA-PL合成的酶失活，例如SCD1和ACSL3，使癌细胞对铁死亡敏感。

2）铁代谢

铁不仅通过芬顿反应（Fenton reaction）来直接过氧化 PUFA-PL，还是脂质过氧化酶（如 ALOX 和 POR）的必需辅助因子。

细胞的铁存储在铁蛋白ferrintin中，其蛋白量特别是重链的表达减少会增加铁池和以及细胞对铁死亡的敏感程度，NCOA4介导的铁蛋白自噬降解（ferritinophagy）将储存在铁蛋白中的铁释放到不稳定的铁池中，从而促进铁死亡；此外，抑制GOT1也可通过增强ferritinophagy以增加不稳定的铁池，并促进癌细胞铁死亡。

3）线粒体代谢

线粒体在能量和ROS生成，以及PUFA-PL合成中的作用驱动线粒体脂质过氧化和铁死亡。首先，线粒体产生的ROS对于脂质过氧化和铁死亡的发生至关重要。

此外，线粒体中的电子传递和质子泵对 ATP 的产生很重要，在能量（即 ATP）充足的情况下，AMPK 不能被有效激活，从而无法灭活ACC，这促进 PUFA-PL 合成和后续的铁死亡发生。最后，线粒体在细胞代谢的生物合成途径中的作用也有助于铁死亡，其中三羧酸 (TCA) 循环和多种回补反应（anaplerotic reactions，例如谷氨酰胺分解）可通过促进 ROS、ATP 和/或 PUFA-PL 的生成来驱动铁死亡。

四、铁死亡防御系统

铁死亡防御机制涉及细胞抗氧化系统来直接中和脂质过氧化物，主要包括经典的GPX4调控铁死亡机制：GCyst(e)ine/GSH/GPX4系统，GPX4非依赖性铁死亡调控机制：NADPH/FSP1/CoQ10系统，GCH1/BH4/DHFR系统。

1）Cyst(e)ine/GSH/GPX4系统

多年来，被认为是调节铁死亡的唯一机制，而且基因敲除和抑制GPX4活性仍然是引发铁死亡最经典的方法。GPX4具有三种亚细胞定位，即细胞溶质、线粒体和核GPX4，其中细胞溶质GPX4在防御铁死亡中发挥重要作用。

还原型谷胱甘肽 (GSH) 是GPX4的辅因子，由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸合成，其中半胱氨酸是限速前体。

大多数癌细胞主要通过SLC7A11介导的胱氨酸（半胱氨酸的氧化二聚体形式）摄取以获取足够的半胱氨酸，因此，Cyst(e)ine/GSH/GPX4轴被认为构成了防御铁死亡的主要细胞系统。然而，在GPX4失活后，一些癌细胞系仍能抵抗铁死亡，这表明存在额外的铁死亡防御机制。

2）NADPH/FSP1/CoQ10系统

FSP1（铁死亡抑制蛋白1）被认为在某些特定条件下具有促凋亡作用，FSP1可经细胞质或线粒体转位进入细胞核，从而触发DNA降解。

然而近些年的研究显示，FSP1具有平行于Cyst(e)ine-GSH-GPX4轴的抗铁死亡机制。FSP1属于II型NADH：醌氧化还原酶NDH-2家族，是传统线粒体呼吸系统的一个分支，催化与复合体I同样的反应，只是不泵送质子。

FSP1被发现主要定位于脂滴和质膜，是一种清除有害脂质过氧化物的系统。从机制上讲，线粒体外泛醌被FSP1从CoQ10还原而来，既可直接捕获脂质自由基，也可以通过回收α-生育酚来间接充当抗氧化的角色。

3）GCH1/BH4/DHFR系统

一种不依赖于GPX4的铁死亡抑制基因，即鸟苷三磷酸环水解酶GCH1，它是合成四氢生物蝶呤BH4的限速酶。BH4是一种颇具实力的自由基捕获抗氧化剂，但它的回收再利用需要二氢叶酸还原酶DHFR的参与，因此如果阻断二氢叶酸还原酶DHFR，则可协同GPX4抑制剂发挥诱导铁死亡的作用。

以外，BH4还可以通过将苯丙氨酸转化为酪氨酸来促进CoQ10的合成，这是它发挥抗氧化作用的另一种方式。

五、铁死亡相关特征

铁死亡在细胞形态学特征、生化特征以及基因水平特征上都与凋亡、自噬、坏死等传统的细胞死亡方式具有显著的变化，具体表现为：

1）细胞形态学特征

超微形态学特征显示细胞膜断裂，线粒体变小、膜密度增高、线粒体脊减少或消失、线粒体外膜断裂，细胞核大小正常、但缺乏染色质凝聚。电镜下表现为细胞内线粒体变小及双层膜密度增高。

2）生化特征变化

铁和活性氧(ROS)聚集，激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系统，降低胱氨酸的摄取、耗竭胞内谷胱甘肽（GSH），抑制胱氨酸/谷氨酸反向转运蛋白system Xc- 和增加NADPH氧化酶（NOXs），释放花生四烯酸（ARA）等介质。

3）基因水平特征变化

铁死亡受细胞内信号通路的严密调节，包括铁稳态的调节通路，RAS/Raf/MAPK通路以及胱氨酸转运通路。

细胞内Cox2, ACSL4, NOX1, GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain等相关因子发生变化，其中Cox2, ACSL4和NOX1在铁死亡细胞中表达上调; GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain在铁死亡细胞中表达下调。

4）免疫学特征

损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)释放前炎症介质(如HMGB1等)。

六、铁死亡常见检测方法

1）形态学观察
细胞形态观察:

利用透射电镜直接对细胞形态进行观察，细胞发生铁死亡时线粒体变小以及线粒体膜密度较大;
线粒体形态观察:

向细胞内转染LifeAct-GFP荧光蛋白，一定时间后通过有丝分裂追踪器观察线粒体的形态。

2）新陈代谢检测

1.细胞活性检测 CCK-8

2.细胞内铁水平检测

可以使用PGSK探针检测，通过流式细胞术或共聚焦显微镜监测活细胞内铁含量的细胞膜透性染料，在铁死亡的细胞中，PGSK的绿色荧光会减弱。

3.活性氧水平检测

通过C11-BODIPY探针检测，在铁死亡细胞中，探针会由红色转化为绿色。

4.线粒体膜电位检测

可以使用TMRE荧光染料检测，TMRE能够特异性标记有活性的线粒体，是一种细胞膜可穿透性的，正电荷的，橘红色荧光染料。当线粒体膜电位降低时，荧光减弱。

5.qPCR/Western Blot检测

检测细胞内与铁死亡相关的因子变化，例如Cox2, ACSL4和NOX1在铁死亡细胞中表达上调; GPX4, SLC7A11, Ferritin和Ferritin Light Chain在铁死亡细胞中表达下调。

七、铁死亡关键调控分子 SLC7A11

System xc- 是一种不依赖钠的反向转运蛋白，由两个通过二硫键连接的亚基组成，包括重链亚基溶质载体族3成员2 (SLC3A2)和轻链亚基溶质载体族7成员11 (SLC7A11)。

SLC7A11是一种多通道跨膜蛋白，在xc -系统中介导胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白活性，而SLC3A2是一种单跨膜蛋白，是维持SLC7A11蛋白稳定性和适当的膜定位的伴侣。

System xc- 以1:1的比例用胞内谷氨酸来换取胞外的胱氨酸(Cys2)，胱氨酸在谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSS)的催化作用下合成谷胱甘肽(GSH)。

SLC7A11在多种应激条件下被诱导表达，包括氧化应激，氨基酸饥饿，代谢应激和遗传毒性应激，可能是一种适应性反应，使细胞能够在应激条件下恢复氧化还原稳态并维持存活。

激活转录因子4（ATF4）和/或核因子红系相关因子2（NRF2）是调控压力诱导的SLC7A11表达的两个主要转录因子。此外，p53可抑制SLC7A11的转录，从而调节铁死亡，在肿瘤抑制中起关键作用。而ATF3也可以与SLC7A11启动子结合并抑制其表达。

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