生物制药技术复习资料

第一章绪论

1.生物药物的四种类型：应用重组DNA技术制造的基因多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物，如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶；来自动物、植物和微生物的天然生物药物；合成与部分合成的生物药物。

2.生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。

3.生物技术药物的特性：

1)分子结构复杂

2)具有种属特异性

3)治疗针对性强、疗效高

4)稳定性差

5)基因稳定性较为重要

6)可能具有免疫原性

7)体内的半衰期短

8)受体效应，即组织特异性和药效反应快

9)具有多效性和网络性效应

10)检验具有特殊性

第二章基因工程制药

1.基因工程技术：将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌(或细胞）内进行复制和表达的技术。

2.反转录法获得目的基因的步骤：

总RNA的提取；mRNA的纯化；cDNA第一链的合成；引物设计与合成（注意在引物两端适当引入酶切位点或其他载体构建所用到的DNA序列）；聚合酶链式反应（PCR）。

3.克隆载体的三个核心组成包括：复制起始位点、筛选标记、基因插入位点。表达载体比克隆载体多出与转录和翻译相关的元件，如启动子、终止子、非编码区、核糖体结合位点等。

4.基因表达：指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。

5.生物工程宿主菌所满足的要求：

1)培养容易、生长快速：

2)容易获得较高浓度的细胞：

3)能利用易得廉价原料： 

4)不致病、不产生内毒素：

5)发热量低、需氧低、适当的发酵温度：

6)容易进行DNA重组技术操作：

7)产物的产量、产率高：

8)产物容易提取纯化：

6.常用的原核表达宿主菌有：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌。

7.常用的真核表达宿主有：酵母、丝状真菌、动物和植物。

8.论述大肠杆菌和哺乳动物细胞作为宿主的优缺点

大肠杆菌：基因工程研究中采用最多的原核表达体系。

  优点：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细胞破碎容易。

  缺点： ① 不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不足，产品多为胞内产物，提取困难； ②蛋白表达后不能修饰加工（糖基化等）； ③产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基，能引起免疫反应； ④内毒素存留。 

哺乳动物细胞

  优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。

  缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。

9.电击法转化：

将重组质粒与电击感受态细胞混匀，在一定离子强度下加高压电场。离子在电场中运动，使细胞穿孔，重组质粒在离子运动的带动下进入感受态细胞中。

10.热击法转化：

利用阳离子（如钙离子）覆盖细胞膜和重组质粒上的负电性，消除两者之间的排斥力的同时将两者粘附在一起。在热击处理后迅速放回冰上，可实现质粒向感受态细胞的转移。原理可能是热击处理使细胞瞬间膨胀穿孔，收缩后将质粒吞入。也可能是放回冰上后胞内温度与胞外温度差太大，出现液体的热循环，从而将质粒送入感受态细胞中。

11.简述碱裂解法抽提质粒的原理

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA 与线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离它们。在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH 4.8 的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH 至中性时，共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA ，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。

答案亦可绘制下图，并在旁注释说明：

12.结合插图说明蓝白斑筛选的原理：

一些载体（如PUC系列质粒）带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区，该编码区中含有多克隆位点（MCS），可用于构建重组子[3]  。这种载体适用于仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落。而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，称为蓝白斑筛选。

13.依照下图，简述Lac/T7启动子表达系统生产粒细胞集落刺激因子的原理

T7启动子来源于λ噬菌体，其可以被T7 RNA聚合酶专一性结合和启动。T7 RNA聚合酶被整合入宿主的基因组中[如BL21(DE3)菌株]，受到Lac启动子的调控。LacI抑制蛋白抑制T7 RNA聚合酶基因的表达。当加入IPTG（乳糖类似物）后可解除这种抑制，表达出来的T7 RNA聚合酶可以结合到表达载体上的T7启动子上，从而转录G-CSF基因的表达，最终合成产物G-CSF。

这种双重调节，可以避免Lac启动子的泄漏表达，从而降低重组蛋白的本底表达水平。

14.简述表达载体需具备的条件：

（1）载体能独立地进行复制 (复制起点，ori)

（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记

（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别

（4）应具有阻遏子

（5）应具有很强的终止子

（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号

15.简述影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素

⑴外源基因的剂量

⑵外源基因的表达效率：①启动子和终止子的强弱；②核糖体结合位点的有效性；③ SD 序列与翻译起始密码子之间的距离；④密码子组成

⑶表达产物的稳定性

⑷细胞代谢负荷

⑸工程菌的培养条件

16.真核基因在大肠杆菌中的表达位置主要有：细胞质、周质空间和培养基。

17.根据来自酵母的复制序列的构成和特性不同，酵母表达载体分为以下四类：附加体质粒类载体、复制型质粒类载体、着丝粒质粒类载体和整合型质粒类载体。

18.举一个酵母表达载体的例子，并绘制该表达载体的结构。说明各个元件的作用。

19.阐述重组法酵母转基因的原理与操作流程！

20.简述影响目的基因在酵母中表达的因素

⑴ 外源基因的剂量

⑵ 外源基因的表达效率 

①启动子强度

　②分泌信号的效率

　③终止序列的影响

⑶ 外源蛋白的糖基化

外源蛋白经酿酒酵母糖基化后，可靠有效地以活性型分泌到培养基中；某些蛋白质糖基化后更加稳定，便于分离精制。

⑷ 宿主菌株的影响

　①菌体生长力强 

　②菌体内源蛋白酶要较弱 

　③菌体性能稳定 

　④分泌能力强

21.比生长速率:菌体生长速率与培养基中菌体浓度之比。

22.严紧反应：当细菌发现它们处于很差的生长环境，没有足够的氨基酸来维持蛋白质合成时，它们就会停止大部分活动，这种现象称为严紧反应。

23.基因工程菌的不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，这种不稳定性具有下列两种表现形式：分裂不稳定和结构不稳定。

24.简述提高质粒稳定性的方法。

1)选择合适的宿主菌

2)选择合适的载体

3)施加选择压力

4)分阶段控制培养

5)控制培养条件

6)固定化

25.大肠杆菌培养工艺中值得优化的地方有哪些：

培养基：碳源；无机磷（增加基质，优化营养物质种类和配比）

接种量：与生长速率适应

温度：魔斑；mRNA浓度；蛋白活性和包含体生成

溶解氧：细胞生长；低于20%产生杂蛋白（提高氧分压；血红蛋白基因引入；与小球藻混合培养）

pH：生长最佳7.0，生产最佳pH与之不同时注意及时调整

诱导时机：对数生长期或后期，同时注意营养和氧气的供应

诱导表达程序：升温时间长，热激蛋白含量升高，目的蛋白则减少——热蒸汽处理2min左右！

26.基因工程菌的培养方式：

1、分批培养：培养基的量一次性加入，产品一次性收获,分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体密度也有限。

2、补料分批培养：在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，可得到更多的代谢产物。

3、连续培养：不断地流加营养，并不断地取出发酵液。连续培养则多用于动力学特性和稳定性等研究。

4、透析培养

5、固定化培养

27.补料分批培养（流加式培养）

指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。

28.补料分批培养（流加式培养）的优缺点

优点：由于只有料液的输入，没有输出，因此发酵液的体积在增加。与分批发酵相比，通过向培养系统中补充物料，可以使培养液中的底物浓度较长时间的保持在一定的范围内，既保证了菌体细胞的生长需要，又不造成阻遏抑制等不良影响，从而达到提高产物浓度的得率的目的。

缺点：容易造成产物的积累，容易染菌，而且中间补料会造成发酵液的稀释。 

29.连续式培养

是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜的培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应器液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。 

30.连续式培养的优缺点：

优点: 操作简便，生产效率高，可长期进行生产，反复收获产品，而且可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。能够更有效的实现机械化和自动化，降低劳动强度；减少设备清洗，准备和灭菌等非生产占用时间，提高设备利用率。

缺点：首先放掉发酵液的同时会损坏未被利用的营养物质和正处于代谢活跃状态的菌体细胞。其次中间补料会造成发酵液的稀释，增加下游提取液的体积，再次，发酵液中一些由代谢产生的前体有可能丢失，造成发酵产物产量的影响。对设备、仪器及控制元件的技术要求较高。粘性丝状菌菌体容易附着在器壁上生长或发酵液内结团，带来操作困难。此外，染菌问题也是影响发酵过程能否进行的重要因素总之，连续发酵营养物利用率低于单批培养，一般只能维持数月至一年。

31.灌流式培养

是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。

32.灌流式培养的优缺点：

优点：

 ①细胞可处在较稳定的良好的环境中，有害代谢物浓度低；

 ②可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量

 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；

 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。

缺点：此方法最大困难是污染机率较高。

33.发酵罐的组成部分有：

1)发酵罐体

2)保证高传质作用的搅拌器、

3)精细的温度控制和灭菌系统、

4)空气无菌过滤装置

5)残留气体处理装置

6)参数测量与控制系统（如 pH、O2、CO2 等）

7)培养液配制及连续操作装置等。

34.高密度发酵是一个相对概念，一般是指培养液中工程菌的菌体浓度在50 gDCW/L以上，最高值可达200 gDCW/L。

35.包含体：重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集，所形成的这种不溶的、无活性的聚集体称为包含体。

36.基因工程药物的质量控制包括：生物材料、培养过程、纯化过程和目标产品的质量控制。

37.简述蛋白质药物产品的质量控制要点

1. 生物活性测定

2. 理化性质测定

（1）非特异性鉴别

（2）特异性鉴别

（3）相对分子量的测定：

（4）pI测定：

（5）肽图分析

（6）氨基酸成分分析：

（7）部分氨基酸序列分析：

（8）蛋白质二硫键分析

3. 蛋白质含量

4. 蛋白质纯度分析

5. 杂质检测

6. 稳定性考查

7. 产品一致性的保证

38.蛋白质药物产品的液态保存方法有：低温保存、在稳定pH下保存、高浓度保存和加保护剂保存。

第三章动物细胞工程制药

2.用于生产的动物细胞的类型有：原代细胞、二倍体细胞系、转化细胞系、融合细胞系和基因工程细胞系。

3.动物细胞培养基的种类包括：天然培养基、合成培养基和无血清培养基。

4.消化分离法：消化分离法是先从生物体取来组织块，将其剪碎，并用消化液将其消化，使组织松散成细胞悬液，然后用缓冲液洗涤、离心、去除残留的消化液而获得所需细胞。

5.体外培养细胞的生长条件：

环境无毒和无菌；适宜的温度；一定的气体环境和pH值；一定的渗透压；充足的营养物质。

6.动物细胞的生理特点：

分裂周期长；绝大多数细胞需贴附于基质，并有接触抑制或密度抑制现象；正常二倍体细胞的生长寿命是有限的；动物细胞对周围环境十分敏感；对培养基要求高；蛋白质合成途径与修饰功能与细菌不同。

7.原代培养期：

也称初代培养期，指从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段，一般持续1-4周。此期细胞移动比较活跃，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形状与体内细胞相似性大。

8.传代（细胞系）：原代细胞生长一定时间后，贴壁型细胞就会连接成片而铺满整个支持物，需要将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程叫传代。（传代后的细胞称细胞系）。此期细胞增殖旺盛并维持二倍体核型。

9.无限细胞系：细胞永生性也称不死性，即细胞获得持久增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，或连续细胞系。

10.传代期，每代动物细胞在培养过程中的特点如何：

潜伏期：潜伏期为细胞从接种到贴壁培养生长繁殖的一段时间，有运动和代谢，但无分裂。

指数生长期：细胞随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行试验研究。

平台期：此期细胞已将其支持物表面占满，细胞活力减弱，已不再进行分裂增殖。

11.接触抑制：细胞从接种到长满底物表面后，由于细胞繁殖数量增多互相接触后，不再增加的现象。

12.常用动物细胞简写及来源：

人：MRC-5、 WI-38、 Namalwa 

猴：Vero、 COS

鼠：BHK-21、 CHO-K1、 SP2/0-Ag14

狗：MDCK

昆虫：Sf-9

13.灌流式培养优缺点：

优点：

①细胞可处在较稳定的良好的环境中，有害代谢物浓度低；

②可极大地提高细胞密度，从而极大地提高了产品产量

③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利于产品质量的提高；

④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高，生产成本明显降低。

缺点：此方法最大困难是污染机率较高。 

14.动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养，其中贴壁-悬浮培养又包括微载体培养、包埋和微囊培养以及结团培养。

15.灌流式培养：当细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培养的培养方法。

16.简述动物细胞生物反应器的类型。

搅拌釜式生物反应器；

气升式生物反应器；

中空纤维式生物反应器；

透析袋或膜式生物反应器；

固定床或流化床生物反应器

17.质粒载体转化哺乳动物细胞后的筛选系统：二氢叶酸还原酶系统、谷氨酸合成酶系统。原理、区别？

18.什么是病毒载体？病毒载体的结构组成（三质粒包装体系的载体结构）以及侵染原理。如何利用病毒载体进行免疫治疗？

19.CRISPR-Cas9基因编辑的原理是？载体构造如何？

第四章抗体制药

1.单克隆抗体：针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的抗体称为单克隆抗体。

2.简述杂交瘤细胞法制备单克隆抗体的步骤：（也要会详细描述！）

1)用抗原免疫动物；

2)细胞融合与杂交瘤细胞的选择；

3)筛选阳性克隆与克隆化；

4)杂交瘤细胞抗体性状的鉴定；

5)单克隆抗体的大量制备与纯化。

3.HAT培养基：单克隆抗体制备时用来筛选杂交瘤细胞的培养基，其中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）。

4.HAT培养基筛选杂交瘤细胞的原理

单克隆抗体是由鼠脾细胞和骨髓瘤细胞融合后产生的杂交瘤细胞产生的。在细胞融合后，为了将杂交瘤细胞与其他细胞（脾细胞、脾脾融合细胞、瘤细胞以及瘤瘤细胞）分开，可以使用HAT培养基进行阳性筛分。HAT培养基中含有次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶（T）。其中，A能阻断内源DNA合成途径，瘤细胞和瘤瘤融合细胞因不能合成DNA而死亡。尽管脾细胞和脾脾融合细胞具有外源型DNA合成途径，即利用H和T合成DNA，但是脾细胞和脾脾融合细胞不能在体外生存，而在几天内迅速死亡。杂交瘤细胞分别兼具了瘤细胞和脾细胞的体外生存能力和外源型DNA合成能力而能够在HAT培养基中顺利增殖，从而达到筛选目的。

5.人-鼠嵌合抗体

将抗体中鼠源性的可变区保留下来，而将恒定区用人的进行替换所形成的单克隆抗体就是人-鼠嵌合抗体。

6.改形抗体

将鼠源性单克隆抗体中参与构成抗原结合部位的区域，H和L链V区中的互补性决定区（CDR），替换人Ig分子中的CDR序列所形成的抗体分子，被称为改形抗体。

7.Fab抗体

用胃蛋白酶可将IgG的重链在铰链区的C端处裂解，获得两个完全相同的可以结合抗原的蛋白质片段，称为抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）称为Fab抗体。

8.Fv抗体

由重链和轻链可变区组成的抗体称作Fv抗体，天然Fv片段中VH和VL以非共价键结合。

9.svFc抗体

scFv抗体，即单链抗体，是由一段弹性连接肽把抗体可变区重链（VH）和轻链可变区（VL）相连而成，是具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。

10.抗体诊断试剂包括：血清学鉴定用的抗体试剂、免疫标记用的抗体试剂、导向诊断药物和分化簇（CD）单克隆抗体系列等。

11.抗体治疗药物包括：放射性同位素标记的抗体治疗药物、抗癌药物偶联的抗体药物和毒素偶联的抗体药物等。

12.详细叙述噬菌体展示技术的原理与操作流程！

第五章植物细胞工程制药

1.绘制植物表达载体的通用结构示意图

细致阐述农杆菌介导植物遗传转化的原理和操作流程！

2.脱分化

已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞和组织的过程。

3.再分化

通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下成为胚状体或直接分化出器官的过程。

4.外植体

用于植物细胞、组织培养的器官或组织，或器官与组织的切段。

5.次级代谢产物

次级代谢产物是指生物生长到一定阶段后通过次级代谢合成的分子结构十分复杂、并非是该生物生长和繁殖所必需的小分子物质。

6.植物组织和细胞培养所用培养基的组成

无机盐；碳源；植物生长调节剂；；有机氮源；维生素。

7.两步培养法

在生物发酵过程中，先使用适合细胞生长的培养基提高细胞密度，再换用适合生产用的培养基提高细胞生产能力的培养方法叫做两步培养法。

8.诱导子

植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物自身防御反应的因子，包括侵染植物的昆虫、微生物上的分子以及植物细胞内源性分子。

9.向培养基中加入固相或疏水液相形成的两相培养法可减轻反馈抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸的影响。

10.生物转化

也称生物催化，是指利用生物离体培养细胞或器官及细胞器等对外源化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生物化学反应。

第六章酶工程制药

1.固定化酶

所谓固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。

2.固定化酶的特点：

固定化酶最大的特点是既具有生物催化剂的功能，又能具有固相催化剂的特性。具体优缺点如下：

1)可以在较长时间内多次使用，而且多数情况下，酶稳定性提高；但是酶活力可能有损失。

2)酶与底物和产物易与分开；

3)反应条件易与控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；

4)酶的利用率高；

5)比水溶性酶更适合于多酶反应，但不如完整菌体；

6)更适合小分子底物的催化，对大分子不适宜。

3.酶和细胞固定化的方法有：

载体结合法：物理吸附法、离子结合法和共价结合法；

交联法：交联酶法、酶-辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法；

包埋法：网格型包埋和微囊型包埋；

热处理法。

4.人工模拟酶

指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。

5.按照模拟酶的属性可将其分为：主-客体酶、胶束酶、肽酶、半合成酶和分子印迹酶。

6.分子印迹

所谓分子印迹是指制备对某一特定化合物具有选择性的聚合物的过程，这个特定化合物叫印迹分子或模板分子。

7.抗体酶

一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性，这种抗体叫做抗体酶。

第七章发酵工程技术概论

1.菌种选育包括自然选育、诱变选育、杂交选育等经验育种方法，还包括控制杂交育种、原生质体融合、基因工程等定向育种方法。