基因工程—目的基因的筛选与获取【选必三】|0基础救星!

3.2.2 目的基因的筛选与获取
一、基因工程基本操作概述
基因工程的基本操作程序:
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定

1.目的基因的定义及结构
(1) 目的基因的定义及种类
在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。 根据不同的需要,目的基因是不同的,它主要是指编码蛋白质的基因, 如与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。例如培育转基因抗虫棉的目的基因——Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。

2.筛选合适的目的基因
随着测序技术的发展,以及序列数据库(如GenBank),序列对比工具(如BLAST)等的应用,越来越多的基因的结构和功能为人们所知,所以从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
3.目的基因的获取方法
根据目的基因的有关信息,获取目的基因。

二、目的基因的筛选与获取
【方法一:直接从供体生物细胞中分离目的基因】
最常用的方法是:“鸟枪法”,又叫“散弹射击法”。
适用对象:从简单的基因组中分离目的基因,如原核基因、质粒或病毒。
具体操作:用限制酶将供体细胞的DNA切成许多片段,将这些片段分别载入运载体,然后通过运载体分别转入不同的受体细胞,让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在受体细胞中大量复制(即扩增),从中找出含有目的基因的细胞(菌落原位杂交法、基因产物检测法等)。

【方法二:从基因文库中分离目的基因】
基因文库:将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入到受体菌的群体
中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因。分为基因组文库和部分基因文库(如cDNA文库)


【方法三:化学合成法】
1.适用对象:长度短且碱基序列已知的DNA的合成。例如,合成PCR的引物、基因探针、人工接头等。
2.根据已知的氨基酸序列合成DNA:

【方法四;利用PCR获取和扩增目的基因】
1.前提:DNA片段序列完全已知或至少其两端20bp左右序列已知以便设计引物
2.过程:90℃以上(变性)→50℃左右(复性)→72℃左右(延伸)
3.条件:模板DNA,dNTP,引物,TaqDNA聚合酶,缓冲液,Mg"。
4.扩增DNA检测方法:琼脂糖凝胶电泳
【方法五:RT(反转录)一PCR法】

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