USP22对抑制子E2F6的去泛素化促进肝细胞癌中的AKT激活和肿瘤生长

写在前面

        今天推荐的是由上海交通大学医学院附属仁济医院上海肿瘤研究所在2021年7月28日发表于Cancer Letters（2020IF：8.680，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Yongzhong Liu教授，研究表明USP22对抑制子E2F6的去泛素化促进肝细胞癌中的AKT激活和肿瘤生长。

研究背景

        肿瘤相关蛋白的失调泛素化在肿瘤的发展和进展中起着关键作用。去泛素化酶USP22在某些类型的癌症中异常表达，并有助于侵袭性肿瘤进展。然而，USP22在肝细胞癌(HCC)中促肿瘤功能的确切机制仍不清楚。

摘要部分

        在这里，作者报告E2F6是一种蛋白口袋非依赖的转录抑制因子，对HCC细胞生长至关重要，并且其活动受USP22介导的去泛素化控制。USP22与E2F6相互作用并稳定E2F6，导致磷酸酶DUSP1的转录抑制。此外，涉及E2F6抑制DUSP1的过程增强了HCC细胞中的AKT激活。因此，这些发现提供了对USP22介导的致癌AKT信号控制的机制见解，强调了USP22-E2F6调控在HCC发展中的重要性。

研究内容

1.USP22与E2F6相互作用并稳定E2F6     

        为了评估可能在HCC中经历USP22介导的去泛素化的蛋白质，作者使用Huh7细胞进行了IP-MASS分析。作者发现USP22免疫沉淀物中存在的三种转录抑制因子，即E2F6、IKZF2和E2F7，可能参与USP22-介导的肿瘤细胞中基因转录的抑制。TCGALIHC数据集的分析进一步表明仅E2F6在HCC样本和非肿瘤组织之间差异表达，表明E2F6在HCC中的临床相关性。因此，作者验证了E2F6和USP22的相互作用；结果显示E2F6是一种蛋白口袋非依赖的转录抑制因子，能够与USP22相互作用，表明E2F6介导的转录抑制可能与USP22在HCC中的功能有关。

        鉴于去泛素化酶(DUB)在维持其靶蛋白稳定性方面的功能，作者认为USP22可能通过抑制E2F6的降解来促进E2F6的积累。正如预期的那样，USP22的敲低显着降低了HCC细胞中的E2F6蛋白水平。然而，USP22下调并未减弱转录E2F6水平。值得注意的是，由USP22抑制引起的E2F6蛋白水平的降低可以被蛋白酶体抑制剂MG132逆转，表明USP22通过抑制蛋白酶体机制介导的降解来增加E2F6的稳定性。为了确定E2F6积累是否需要USP22的去泛素化酶活性，作者生成了USP22 C185A，USP22的酶促失活突变体，并发现USP22 C185A未能增加HCC细胞中E2F6的蛋白质水平。由于K48连接的多泛素修饰与蛋白酶体依赖性降解过程相关，作者将表达E2F6、HA-泛素（WT或仅K48-linakge）和USP22的载体共转染到HEK293T细胞中。正如预期的那样，WT USP22，而不是USP22 C185A，减少了与E2F6蛋白缀合的WT和K48连接的多泛素链的数量。

研究结论：USP22介导的去泛素化功能对于E2F6的稳定至关重要。

2.在HCC中E2F6和USP22表达相关

        为了探究USP22介导的E2F6稳定性调节的临床相关性，作者分析了USP22和E2F6蛋白在成对的人类HCC和正常组织标本中的表达模式。免疫印迹分析的结果显示，与邻近组织相比，USP22和E2F6蛋白水平分别在75.0%和60%肿瘤标本中上调。此外，几乎所有E2F6表达增加的肿瘤组织都具有高水平的USP22。为了探索USP22-E2F6调控在HCC中的功能重要性，作者通过RNA-seq研究了有无USP22或E2F6沉默的Huh7细胞的转录谱。然后作者根据E2F6或USP22缺失引起的转录改变生成了四个特征，即E2F6 ACTIVITY UP或USP22 ACTIVITY UP和E2F6 ACTIVITY DOWN或USP22 ACTIVITY DOWN，以分析源自TCGALIHC和ICGC数据库的HCC的转录数据。USP22和E2F6的活性之间的相关性分析具有统计学意义。样品的GSEA分析显示E2F6 ACTIVITY DOWN基因在USP22低表达的肿瘤中富集表达， E2F6 ACTIVITY UP基因在USP22高表达的肿瘤中富集表达。通过生成的E2F6特征对有无USP22敲低的Huh7细胞的转录谱分析表明，一组受E2F6正调控的基因被USP22沉默转录抑制，而一些E2F6 ACTIVITY DOWN基因被USP22沉默转录上调。这些结果表明USP22和E2F6之间相互作用在HCC中的功能意义。为了解决USP22和E2F6的临床结果，作者使用USP22和E2F6 ACTIVITY分析对来自TCGA或ICGC数据库的HCC样本进行了分类，结果表明存活概率与HCC样本中的USP22活性或E2F6活性呈负相关。为了进一步证实作者的结果，作者将USP22过表达的Huh7细胞皮下注射到裸鼠中，发现USP22过表达显着促进了肿瘤的生长，其中在表达外源性USP22的肿瘤中观察到E2F6积累增强。

研究结论：USP22表达升高与E2F6水平及其在HCC中的活性相关。

3.USP22-E2F6轴促进肿瘤细胞生长并促进AKT激活

        接下来，作者研究了E2F6和USP22在HCC中的生物学功能。作者的结果表明，敲低E2F6或USP22导致细胞增殖显着下降，表明E2F6和USP22对肿瘤细胞生长都是必不可少的。一致地，E2F6或USP22的过表达增强了肝癌细胞的增殖。由于作者的发现将E2F6定位在USP22的下游，作者设想USP22的促肿瘤发生活性可归因于E2F6在HCC细胞中的功能。事实上，在肝肿瘤细胞中沉默E2F6可显着逆转USP22对细胞生长的影响。此外，异位E2F6表达部分恢复了HCC细胞中USP22敲低引起的生长抑制。另一方面，即使在USP22过表达的情况下，裸鼠中Huh7细胞的肿瘤形成能力也被E2F6敲低完全削弱。这些结果表明USP22介导的E2F6稳定是调节HCC细胞生长的关键因素。

        据报道，USP22有助于HCC细胞中AKT信号的过度激活。一致地，作者发现USP22有效地促进了Huh7和HepG2细胞中的AKT激活。为了研究E2F6是否参与USP22促进的AKT激活，作者检查了有无E2F6的细胞中的p-AKT水平。发现沉默E2F6显着削弱了稳态下的AKT磷酸化并有效抵消了USP22介导的AKT激活，表明E2F6稳定性决定了USP22诱导的HCCAKT的过度激活。

研究结论：USP22-E2F6轴促进肿瘤细胞生长并促进AKT激活。

4.E2F6对DUSP1的抑制导致HCC细胞中的AKT激活

        为了调节AKT激活，作者分析了从有无USP22或E2F6沉默的细胞中获得的RNA-seq数据。结果表明，在敲除USP22或E2F6的细胞中显示差异表达的磷酸酶中，DUSP1同时上调。一致地，通过测量USP22敲低后细胞中六种磷酸酶的蛋白质水平，作者发现只有DUSP1蛋白质丰度显着增加。类似地，在E2F6敲低细胞中观察到DUSP1蛋白水平增加。为了证实这些结果，作者随后分析了TCGALIHC肿瘤标本中磷酸酶的转录谱。与USP22高表达的样本相比，发现DUSP1表达仅在USP22水平低的样本中增加。为了确定E2F6参与USP22介导的DUSP1抑制，作者敲低了过表达USP22的肿瘤细胞中的E2F6。结果表明，沉默E2F6有效地逆转了USP22介导的DUSP1抑制。接下来，作者使用ChIP-PCR确定了E2F6在DUSP1上的结合位置。正如预期的那样，E2F6能够结合到DUSP1启动子区域，并且这种结合受到USP22沉默的负调节。因此，作者的数据表明DUSP1转录的抑制可能是USP22-E2F6在HCC中的功能的基础。接下来，作者研究了DUSP1抑制是否参与USP22介导的AKT激活。观察到异位DUSP1表达显着抑制AKT磷酸化，而敲除DUSP1增加磷酸化AKT表达。

研究结论：USP22通过E2F6介导的DUSP1抑制激活AKT信号传导。

5.DUSP1消除USP22-E2F6介导的HCC肿瘤细胞生长

        DUSP1已被确定为负调节HCC中肿瘤增殖的肿瘤抑制因子。因此，作者探讨了DUSP1对USP22在肝肿瘤细胞中促肿瘤发生活性的影响。作者观察到DUSP1敲低显着改善了细胞增殖，而异位DUSP1表达产生了相反的效果。值得注意的是，DUSP1表达足以消除由USP22过表达引起的细胞增殖增强。相反，由E2F6抑制引起的肿瘤细胞增殖受损可以通过DUSP1抑制显着抵消。

研究结论：E2F6对DUSP1的下调是导致USP22在HCC中促肿瘤发生功能的关键事件。

结论与讨论

        在本研究中，作者发现敲除DUSP1增强了AKT信号通路,而USP22介导的致癌作用需要E2F6抑制DUSP1。因此，在此作者提供证据表明USP22-E2F6轴对DUSP1的抑制是激活AKT信号传导并驱动HCC生长的上游事件对由USP22、E2F6和DUSP1组成的分子机制在HCC中的功能的认识可能有助于设计治疗HCC的新策略。

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原文链接：https://doi.org/10.1016/j.canlet.2021.07.044