原核生物反转录PCR——生物制药综合实验

一、实验目的

（1）掌握反转录PCR的原理

（2）掌握反转录PCR的操作技术

（3）以原核生物为材料进行cDNA的扩增

二、实验原理

（1）反转录PCR原理

（2）PCR扩增原理

三、材料、试剂、仪器与设备

（1）材料：大肠杆菌过夜培养物

（2）试剂：RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR mix

（3）仪器与设备：移液枪、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、天平、电磁炉等

四、实验过程

（1）细菌RNA提取

① 挑取大肠杆菌单菌落于 LB 中37 ℃ 180 rpm 振荡过夜培养。

② 向 1.5 mL 离心管中加入 1 mL 菌液，12,000 rpm 离心 2 min。除去上清留下菌体沉淀。

③ 用 100 µL溶菌酶重悬菌体沉淀并轻轻敲打混匀。

④ 加入200 µL RNA裂解液，混匀，室温孵育3-5 min。

⑤ 加入300 µL RNA稀释液，混匀，室温放置3-5 min。

⑥  加入 0.5 倍体积无水乙醇，充分混匀，并将此混合物转移到离心柱装配体中。

12,000 rpm 离心 1min。

⑦从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体。将离 心柱装回到收集管上。加 600 μL RNA 洗液于离心柱装配体，12,000 rpm 离心 1 min。

⑧加入50 μL DNA酶I孵育液，室温孵育15min。

⑨重复⑦两次。 

⑩ 清空收集管，12,000 rpm 离心 2 min。将离心柱从收集管上转移到 1.5 mL 洗脱管上，向膜上加 60 μL 无核酸酶水。

14,000 rpm 离心 1 min。丢弃离心柱。盖好RNA 的洗脱管，存于‐80 ℃保存备用。

（2）cDNA合成

① 于冰上加入以下反应组分：

总 RNA                            50 ng ~ 1 μg

RTIII All-in-one Mix          4 μL

dsDNase                         1 μL

Nuclease-free water           to 20 μL

② 轻轻吸打混匀，瞬离。

③ 37 ℃温育2 min，去除基因组DNA；55 ℃温育15 min 。

④ 85 ℃温育5 min以终止反应，迅速将获得的cDNA置于冰上。

（3）16S rDNA扩增与检测

反应体系（25 μL）： 

cDNA 模版                  1 μL

上游引物（10 μM）    1 μL

下游引物（10 μM）    1 μL

PCR Mix (2X)             12.5 μL    

       ddH2O                 9.5 μL

 反应程序：

95 ℃ 3 min；94℃ 30 sec，56 ℃ 30 sec，72 ℃ 2 min，35 循环；72 ℃ 5min；

12 ℃保存。取 5μL PCR扩增反应产物，于1％琼脂糖凝胶中进行电泳检测。

五、实验结果记录

1、RNA提取过程注意事项有哪些？2、提高RNA提取浓度和质量的方法？