一种自组装纳米颗粒：对开发热稳定疫苗候选物的意义

 

关键词：自组装纳米颗粒        纳米疫苗        增强免疫原性

 

摘要

有效控制病毒感染有赖于疫苗技术的不断发展。纳米粒子（NP）抗原由于其独特的物理化学性质而具有高度的免疫原性，使其成为呈现可溶性抗原的分子支架。在这里，病毒靶点（113-354aa）基因融合到mi3的N末端，mi3是一种由60个亚基自组装成的纳米颗粒蛋白。通过透射电子显微镜，可以观察到形成了在mi3的N端融合插入了354个aa的蛋白。除此之外，如动态光散射所示，病毒基因在NP上面显示。NP可以在室温条件下长期储存并表现出完美的稳定性。此外，SP-E2-mi3可以上调标记分子和免疫刺激细胞因子来增强树突细胞（DC）中抗原的摄取和成熟。重要的是，在小鼠模型中，与单体E2蛋白相比，针对猪瘟病毒（CSFV）的SP-E2-mi3纳米疫苗显著改善了猪瘟特异性中和抗体(NAbs)和细胞免疫相关细胞因子（IFN-r和IL-4)。特别的，针对CSFV石门和HZ-08菌株的NAb滴度增加了10倍以上，改善了NAb应答，表明针对不同基因型的交叉保护更好。总之，这种基于结构的自组装NP可以作为提高亚单位疫苗对新出现病原体的效力提供了一个有吸引力的平台。

 

1 引言

在越来越多的病例中，基于灭活或者减毒病原体的传统疫苗无法有效控制新出现的传染病。尽管它们可能在宿主中诱导特异性免疫应答，其特征是有效的T细胞、B细胞应答和记忆免疫，在疫苗生产和应用中使用潜在的具有致病性的活微生物导致了对安全性的担忧，从而限制了其应用。最近世界范围内出现的重要流行性疾病进一步增加了对旨在提高免疫原性和安全性的新型疫苗策略的需求。因此，考虑到与传统疫苗策略相比的优势，包括缺乏毒力因子，易产性、生物安全性和DIVA（感染和接种动物之间的区别），基因工程亚单位疫苗已经越来越流行。

通常，病原免疫原性在很大程度上受抗原的物理化学性质影响。具有优异免疫原性的常规灭活或减毒病原体可为改进提供关键参考，包括，a.减毒病原体的复制效率、b.高度重复和有序的表面抗原阵列、c.颗粒抗原的性质以及d.同时激活先天免疫和适应性免疫的能力。

基于这些发现，已经提出多种方法来增强亚单位疫苗的免疫原性，其中包括通过偶联到大蛋白载体或佐剂来增加抗原的大小、抗原多聚化和颗粒载体上高度重复抗原的表面展示。

生物活性蛋白质分子相互作用并自行排列，形成有序的结构，与自然状态下的功能密切相关。天然自组装蛋白纳米颗粒（SAPN）在病毒衍生的蛋白质中有很好的表现，如烟草花叶病毒（TMV）衣壳和乙肝病毒（HBV）表面抗原（HBsAg)。此外，早在1981年，德雷克斯勒就首次提出了使用自组装蛋白质作为单体构建块的蛋白质分子工程。从那时起，通过模拟一些自然结构衍生出的自组装概念使得科学家能够构建各种自组装纳米材料，用于各种生物医学应用，如疫苗、药物输送和医学成像。SAPN通常由多种高度重复的基序组成，可用于外源表位或蛋白质整合。这些嵌入的分子表面显示在组装的颗粒上。这些嵌合SAPN是生物医学领域中抗原表位和蛋白质递送的理想载体。SAPN上外来抗原的空间排列类似于自然病原体上的病原体相关分子模式（PAMP），其特征在于高抗原密度和高度有序的结构，从而增强抗原和BCR之间的交联反应。这种多重相互作用对于激发免疫反应至关重要，这为提高亚单位疫苗的免疫原性提供了一种替代方案。

对于疫苗递送，基于NP的疫苗在诱导适应性免疫和先天免疫方面方面比亚单位可溶性抗原具有许多改进的特性。纳米尺寸的颗粒可以改善DC中的抗原吞噬和内化，作为最强大的APC，其在启动有效免疫应答中发挥关键作用，相较于可溶性抗原，APC更喜欢通过内吞作用内化NP。与通常MHCII类途径呈现的可溶性蛋白抗原不同，NP抗原内化到APC中促进了通过MHCII和MHCI类途径的交叉呈现和交叉启动，随后增强了CD8+CTL免疫应答。此外，NP本身也作为递送系统发挥辅助作用。除了增强抗原内化和呈递外，NP可以促进先天免疫的激活、免疫刺激性细胞因子的分泌及DC的成熟和迁移，这反过来促进免疫反应的初始化。

VLPs（类病毒颗粒）是一种自组装NP，在疫苗开发中取得巨大成功，可以弥补传统减毒或灭活疫苗的缺点。它们仅与选定的病毒蛋白组装，并紧密模拟天然病毒颗粒的三维结构，从而使得它们成为非传染性但高度免疫原性的抗原。基于VLP的疫苗很好的证明了这一点，包括针对乙型肝炎、宫颈癌和戊型肝炎的疫苗。在针对不同感染的临床试验阶段，对越来越多的基于VLP疫苗的实验进行了评估。然而，大多数病毒保护抗原，如猪瘟病毒E2，不能天然形成VLP，限制了疫苗的效力，也导致了对SAPN颗粒疫苗的迫切需求。

猪瘟的出现和再次出现给养猪业带来了持续的威胁和巨大的经济损失。尽管毫无疑问，减毒疫苗可以提供对猪瘟病毒的全面保护，但它不能提供DIVA特性，从而阻碍猪瘟的根除。由于E2糖蛋白在免疫动物中诱导中和抗体，因此被认为是亚单位疫苗开发的主要靶点。基于E2可溶性的疫苗可以诱导有效的中和抗体，但是需要多次接种才能获得足够的保护，因此尚未在CSF流行地区成功推广。因此需要改进以提高亚单位疫苗的保护效力，基于NP的递送技术可能提供一种强大的替代工具。

通常，广泛的靶抗原通过基因工程融合表达或化学偶联与NP连接，并显示在表面上。由于偶联位点的异质性和抗原的物理化学性质导致化学偶联具有挑战性。PH、离子强度、温度、抗原疏水性和对化学修饰的敏感性可能会导致结合效率的变化，从而损害疫苗抗原的稳定性和免疫原性。基因融合是容易的去操纵在NP外表面，因此通过高度有序、对称的结构抗原，并在宿主免疫系统中重复排列，从而增强这种弱免疫原的抗原呈递。当涉及基于NP的疫苗设计时，应考虑四个关键因素：插入大小（抗原/表位大小）、NP形成能力、NP稳定性和抗原/表位的表面展示，它们与NP疫苗的免疫效力密切相关。先前的研究表明，基于二十面体纳米笼的计算设计，i301和mi3能够自行排列，自发形成高度有序的60亚基的二十面体，这是基于NP的新型疫苗设计的一种有前途的替代方案。然而，包括插入能力和免疫效力在内的许多问题仍有待验证。

在本研究中，我们专注于通过基于NP的技术提高亚单位疫苗的保护效力。为此，开发了自组装纳米颗粒（mi3）,并将其表征为疫苗递送支架。将不同大小的病毒靶蛋白基因融合到mi3的N末端。插入不会损害NP的形成，并且通过DLS证明靶蛋白存在于mi3 NP的表面。然后，我们在体外研究了这种SP-E2-mi3对APC的佐剂作用，以评估其在疫苗开发中的潜力。此外，针对CSFV的基于SP-E2-mi3 NP的新型纳米疫苗被初步生产并评估了其在小鼠中引发的有效免疫应答情况。

 

2.材料与方法

2.1 克隆

合成mi3（GenBank AXF54357.1）的DNA序列，并将其克隆到杆状病毒表达载体pFastBac HTA(Invitrogen,Carlsbd,CA,USA)中，以生成pFastBac-mi3。将包括GP5ab(113aa)、Cap(42-234aa,GenBank MH920578.1)、sfGFP(249aa,GenBank ASL68970.1)和CSF SP-E2的靶蛋白分别引入mi3上游的pFastBac-mi3中。柔性接头（GGS）4结合在靶蛋白和mi3之间，以避免空间位阻并允许适当折叠。所有的质粒采用标准方法构建，并通过DNA测序进行验证。随后按照制造商的说明通过Tn7转座子、杆状病毒提取和转染获得重组杆状病毒。

 

 

2.2 重组蛋白的表达和纯化

在500ml细胞培养摇瓶中培养Sf-9细胞，并调整至每毫升2-2.5x106个细胞，随后，用重组杆状病毒接种细胞。在27°中培养4天，通过5000rpm离心20分钟收获细胞颗粒，并用1mM苯甲磺酰氟（PMSF）的PBS（ph 7.4）中，然后通过超声裂解细胞颗粒，收集含有靶蛋白的上清液并将其装载到2ml琼脂糖树脂上（yeasen中国）。用20mM咪唑的PBS缓冲液洗杂，用含有400mM的咪唑的PBS进行洗脱靶蛋白。随后将得到的纯化蛋白用12% SDS-PAGE进行分析验证，并通过BCA蛋白定量试剂盒（Vazmye 中国）进行定量，并储存在4°直到时用。

2.3. NP自组装的物理化学条件和性质

在16℃条件下制备NP组装溶液（200mM Nacl，50mM Tris,0.1%吐温-20，ph 8.0）,使用管状透析设备（Tube- O-DIALYZER™, Sangon Biotech, Shanghai, China）。通过透视电子显微镜（TEM）进行负染观察NP的形成。简言之，将纯化的靶蛋白-mi3融合蛋白置于铜网上，然后使用2%PTA溶液（PH 6.8）进行60s的负染色。在80KV加速电压下，用JEM1010透射电子显微镜（JEOL Ltd., Tokyo, Japan）检测负染样品，然后通过动态光散射（DLS）测量NP的流体动力学直径和尺寸分布。

2.4.热稳定性和长期稳定性评估

为了评估不同条件下的热稳定性，在4、25、37、50或者65℃下孵育SP-E2-mi3NPs 储备。然后，将样品冷却至4℃，然后用热循环仪将其加热10分钟。通过15000g 30min离心移除聚合物。通过SDS-PAGE分析上清液并通过密度测定法测定。在四度的可溶性定义为100%。

对于长期储存稳定性分析，无菌过滤sp-E2-mi3 NP的储存并在室温下孵育（25℃）。在指定的时间点，将样品离心去除聚集体，并进行TEM拍摄评估NP 的完整性分析。Image J软件（Bethesda, MD, USA）用于计算NP的数量。

2.5. 鼠源骨髓细胞的生成和验证

用RPMI1640从C576BL雄性小鼠的骨髓中获得BMDC，并洗涤两次。红细胞在红细胞裂解缓冲液（Beyotime,中国）中裂解，并收集剩余细胞。随后，将细胞以106个细胞每孔的密度用RPMI-1640完全培养基（含有10%FBS、10ng/ml 小鼠IL-4）重新悬浮在6孔细胞板中。培养基每间隔2天更换一次。培养7天后，大多数细胞已获得典型的树突形态。通过流式细胞术测定纯度后，这些细胞可用于后续实验。

 

2.6. 细胞摄取

为了验证SP-E2或者SP-E2-mi3 NPs的最佳浓度，以便进行进一步的实验，按照试验手册描述，通过MTT细胞活性测定（Thermo Scientific Inc.）评估这些蛋白质对BM-DC的细胞毒性作用。

FITC标记的SP-E2(FITC-SP-E2)和SP-E2-mi3 NP（FITC-SP-E2-mi3 NP），根据用户手册使用商业化试剂盒（Sangon, China）制备。通过以下步骤确定BM-DCs对于SP-E2-mi3 NP的内化。加入100uM FITC-SP-E2或者FITC-SP-E2-mi3 NP并孵育2小时。在通过共聚焦激光扫描显微镜IX81-FV1000 (Olympus)收集荧光图像之前，用75nMLysoTracker Red DND-99 probe (Yeasen, Shanghai)对后期溶酶体染色30分钟。

对于流式细胞术，用100um sp-E2或者sp-E2-mi3 NP刺激培养7天的细胞，PBS作为对照，孵育24小时后，洗涤细胞并用胰蛋白酶制备成细胞悬液。随后，用荧光标记的抗小鼠单克隆抗体PE-CD11c或FITC-CD40（eBioscience, CA, USA）对细胞进行染色。用PBS冲洗以去除未结合的抗体后，然后在BD FACSCalibur flow cytometer (BD Biosciences, NJ, USA)流式仪器上分析细胞。

2.7.BM-DCs标记基因和细胞因子表达的分析

研究SP-E2-mi3 NP对BMDC成熟和细胞因子表达的影响。在使用100um的SP-E2、mi3 NP或者SP-E2-mi3 NP 4小时后，根据制造商的说明，使用Easy RNA Kit (Zhejiang Easy-Do Biotech CO., LTD)试剂盒提取BMDC的总RNA。另外按照制造商所述，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, China) 进行荧光定量PCR（Q PCR），所用引物为先前报道的靶序列设计的，如表1所示，actin作为内部对照，使用2-△△CT法分析数据。

2.8.免疫

6周龄雌性BALB/C被随机分到四组，每组5只，A组和B组分别皮下接种25ug或者40ug SP-E2-mi3 NP，C组接种40ug SP-E2，PBS免疫D组作为阴性对照。通过相同剂量或者给药途径以14dpi进行加强免疫。在不同的时间点，立即采集血清样本以进一步检测猪瘟特异性抗体和中和抗体。动物实验程序由浙江大学试验动物管理委员会监督和批准。

2.9.血清学检测

对0、7、21和28dpi的小鼠血清进行间接ELISA以评估CSFV E2特异性抗体水平。简言之，用100ul/孔浓度为50nM的SP-E2或者mi3蛋白预涂ELISA板子(Corning, USA)，并在4℃过夜。用含有0.05%吐温-20（PBST）的PBS洗涤三次后。在37℃下用PBST中5%的脱脂牛奶封闭平板2小时。随后，加入小鼠血清样本（在PBST中稀释，1:500），并在37℃下孵育1小时。用PBST洗涤三次后，将平板与100ul HRP结合的山羊抗小鼠IgG(在PBST中稀释，1:5000，Sangon, China)，在37℃孵育1小时。用PBST冲洗以去除未结合的抗体后，在室温下加入100ul四甲基联苯胺（TMB）10分钟，然后加入50ul 2M H2SO4停止反应。使用微板读取器（Biotek, USA）读取450nm处的吸光度。根据其他相关研究，在标准中和试验中测试了中和抗体。

2.10.细胞因子检测

根据制造商的说明，使用IL-4和IFN-r检测试剂盒（Boster, Wuhan, China）检测细胞因子表达水平。14和28dpi的血清用于评估IFN-r和IL-4应答。根据标准曲线测定IFN-r和IL-4浓度。

2.11.统计分析

当两组进行比较时，通过 Student's t-test检验进行数据分析，或通过两组以上的单因素方差分析（ANOVA）进行数据分析。P<0.05被认为具有统计学意义。

表1. qPCR使用的引物如下

引物

序列（5’—3’）

GenBank ID

actin

F: GGAGGGGGTTGAGGTGTT

R: GTGTGCACTTTTATTGGTCTCAA

NM_007393.5

MHC II

F: CTGTCTGGATGCTTCCTGAGTTT

R: TCAGCTATGTTTTGCAGTCCACC

NM_207105.3

CD80

F: CCCCAGAAGACCCTCCTGATAG

R: CGAAGGTAAGGCTGTTGTTTG

NM_009855.2

CD86

F: GCCGTGCCCATTTACAAAGGCTCAA

R: TGTTACATTCTGAGCCAGTTTTATT

NM_019388.3

TNF-a

F: GCCTCTTCTCATTCCTGCTT

R: TGGGAACTTCTCATCCCTTTG

NM_013693.3

IL-6

F: GTTCTCTGGGAAATCGTGGA

R: TCCAGTTTGGTAGCATCCATC  

DQ788722.1

 

3. 结果

3.1.用mi3 NP成功组装不同大小的病毒蛋白

为了研究mi3的N端插入容量对NP形成的影响，通过克隆含有C端12xhis的靶蛋白PRRSV GP5m（113aa）、PCV2 Cap（192aa）、sfGFP（249aa）和CSFV SP-E2（354aa）构建了几个质粒（图a）。融合蛋白在sf9细胞中成功过表达，并在天然条件下使用金属亲和层析纯化。如SDS-PAGE分析所描述的，所有蛋白条带均与预测大小一致，纯度超过90%（图b），接下来，用NP组装溶液代替缓冲液进行NP组装，并通过透射电子显微镜（TEM）检查。结果表明，融合蛋白mi3、GP5m-mi3、Cap-mi3、sfGFP-i3和SP-E2-mi3可以自组装成均匀的NP，其直径约为25-35nm图C。值得注意的是，NP的直径随着插入的蛋白质的大小而增加，范围从113aa-354aa。因此，我们推测，根据其空间构象，mi3 N末端融合靶很可能位于NP表面（蛋白质数据库，编号：5KP9，图D），在这里，对于这四种NP，我们的靶抗原显示在NP的表面上。

3.2.DLS表征NP

为了验证颗粒与抗原的组装，DLS用于进一步表征这些NP的流体动力学和zeta电位。从图A-C中可以清楚的看出，SP-E2-mi3 NP插入354aa的平均直径37.1nm，其次是sfGFP-mi3 NP插入249aa的31.4nm，而mi3 NP的平均直径仅为27.3nm。这一结果支持了之前的发现，即mi3 N-末端融合主要延伸到NP外，导致流体动力学尺寸显著增加。此外，源自mi3 N末端融合的spycatcher 的NP可以与spytag（spycatcher的配体）有效结合，这表明mi3 N末端融合靶蛋白位于NP的表面。

Zeta 电位都是NP表征的另一个重要指标。Zeta电位的绝对值越大，NPs的胶体系统越稳定。如图D所示，sfGFP-mi3 NPs的电位为-13.6 mv，其次是SP-E2-mi3 NP的电位为-16mv，它们略低于mi3 NP的-22.7mv。结果表明，N末端融合的SP-E2不会显著改变mi3-NP在NP组装缓冲液中的稳定性。

3.3.SP-E2-mi3 NP表现出完美的热稳定性和长期储存稳定性

对于颗粒组装的有效候选疫苗，考虑到成本和现场效力，确定稳定性至关重要。为了测试纳米颗粒的热稳定性，SP-E2-mi3纳米颗粒在25-65℃温度下，组装缓冲液中孵育1小时。将样品离心以去除聚集体，并通过密度测定法对上清液中的可溶性部分进行定量。加热至50℃导致28%的SP-E2-mi3 NPs 聚集损失，最高65℃，至少45%的NP保持可溶形式。

除了热稳定性，我们还评估了颗粒在室温下的稳定性项。2、4、6周后，通过TEM值分析NP的完整性和数量。结果显示，完整的SP-E2-mi3 NP的百分比在四周内超过了80%，在6周时达到了50%，图3B。此外，SP-E2-mi3 NP的大小分布也很窄，表明其对疫苗接种具有生物活性，图3C。总之，SP-E2-mi3表现出完美的粒度均匀性和长期稳定性。

3.4.SP-E2-mi3 NP促进骨髓树突状细胞的细胞摄取

作为最关键和最有效的APC，DC已经进化为识别和吞噬颗粒和重复结构，如NP以增强T细胞启动和免疫反应。在重组小鼠GM-CSF和IL-4的存在下，从骨髓原始细胞中产生BMDC。培养7天后，通过相差显微镜观察典型的树突形态，图4A。CD11是一种典型的小鼠DC标记物，通常用于体外和体内识别DC。因此，我们根据CD11C的表达水平检查了分离的BMDC的纯度。流式细胞仪显示CD11C阳性占88.05%，图4A。这表明后续实验的高纯度。

为了探讨SP-E2-mi3在小鼠模型上作为自组装疫苗的潜力，首先评估SP-E2-mi3的细胞毒性，然后评估其被BM-DCs吞噬的能力。如预期的那样，SP-E2和SP-mi3-E2在浓度为100uM时候，细胞活力并未受到影响。当SP-mi3-E2的浓度达到200uM时候，细胞的活力急剧下降，但是当SP-E2的浓度达到200uM时候，细胞的活力仍然达到90%以上。与SP-E2相比，当SP-mi3-E2的浓度达到200uM时候，细胞活力下降的可能原因在于纳米颗粒在细胞内的聚集。

随后，我们使用流式细胞术进行抗原的定量检测。与单体SP-E2相比，SP-mi3-E2的内化效率高出了5倍（如图4C，P<0.001）DC成熟的标志是共刺激分子和表面标记物的表达水平上升。暴露于未标记的抗原后，相比较于SP-E2抗原，SP-mi3-E2产生的协同刺激分子CD40的表达明显增强，从而促进了DC细胞的成熟。此外，通过共聚焦激光显微镜检查了FITC-SP-E2-mi3和FITC-SP-E2的内吞和细胞定位。与单体SP-E2相比，SP-mi3-E2 NPs得到更强的荧光信号，表明提高了抗原结合和BM-DC的内吞作用。可能的原因在于与一个单体相比，SP-mi3-E2为60个单体亚基组成的纳米颗粒，使得SP-E2的多重摄取成为可能。

3.5.SP-mi3-E2刺激BM-DC的成熟和细胞因子的分泌

我们接下来检测了SP-E2，mi3 NPs及SPE2-mi3刺激BM-DCs后的表面标记物和细胞因子的表达水平。协同刺激分子及MHC II类分子的上调意味着BM-DCs的成熟，如图6所示，刺激BM-DCs的4小时后，SP-E2-mi3 NPs及mi3NPs组的 MHCII类分子及表面协同刺激分子CD80、CD86水平显著高于SP-E2组（P<0.001）。DCs释放的细胞因子刺激参与细胞免疫反应，并对naïve T cells 分化为 Th1 and Th2起到关键的作用。另一方面，SP-E2-mi3 NPs及mi3NPs组产生的促炎细胞因子水平（TNF-α和IL-6）的结果也和上述结果一致，均显著高于SP-E2。通过这些结果，我们总结出mi3 NPs能够强有力的刺激BM-DCs成熟，是通过促进协同刺激分子 CD80、CD86和MHC II类分子的表达完成。

3.6.SP-E2-mi3能够增强小鼠的体液免疫

作为潜在的疫苗，首次在小鼠上进行SP-E2-mi3的潜在效率评估。采用间接ELISA方法检测CSFV 的E2特异性抗体。如图7A所述，在首免28天，相较于40ug的SP-E2疫苗组，25ug的SP-E2-mi3 NPs疫苗组能够产生更高水平的特异性抗体（P<0.01），在14天（P>0.05），两组没有差异。值得注意的是，相较于40ug的SP-E2组，同样是40ug的SP-E2-mi3疫苗组能够显著的升高特异性抗体（P<0.01），除此之外，这两组与25ug的SP-E2-mi3组相比较而言，也能产生更高水平的抗体（P<0.05）。未能在PBS组中检测到特异性E2抗体。有趣的是，相较于SP-E2组，SP-E2-mi3组能产生更高水平的mi3特异性抗体（图 7B）。这些数据清楚的表明，SP-E2-mi3组产生的E2抗体并不影响SP-E2抗体的产生。

此外，CSFV 1.1基因型（石门株）和临床基因型2.1（HZ08株）被用来进行标准中和抗体实验，评价针对基因型1.1和基因型2.1毒株的交叉反应中和抗体。40ug SP-E2、25ug SP-E2-mi3和40ug SP-E2-mi3组的中和抗体在二免后抗体得到显著性的提升。相较于40ug SP-E2而言，25ug的SP-E2-mi3疫苗组，针对HZ-08毒株的14dpi和28dpi中和抗体水平有显著性差异（P<0.05）。除此之外，40ug SP-E2-mi3疫苗组针对HZ08毒株的中和抗体相较于SP-E2有极显著的差异（P<0.01），如图7C。

如图7D图所示，所有疫苗组的结果，针对石门毒株的中和抗体水平与HZ08毒株的中和水平相似，相较于40ug SP-E2组，40ug SP-E2-mi3疫苗组针对石门毒株的中和抗体水平有显著性差异14dpi（P<0.05），28dpi（P<0.01）。相较于40ug SP-E2组，25ug 的疫苗组SP-E2-mi3针对石门毒株产生更高的中和抗体14dpi（P>0.05）和28dpi（P<0.05）。基于这些结果，mi3自组装疫苗能够提高针对基因型1.1和2.1毒株的交叉中和抗体水平。

3.7.SP-E2-mi3自组装纳米颗粒疫苗能够提高小鼠的细胞免疫

具有固有抗病毒活性和免疫调节作用的IFN-r，在疫苗组SP-E2-mi3中的水平得到显著性提升。如图8所示，40ug SP-E2-mi3的IFN-r水平最高，其次是25ug的SP-E2-mi3，除此之外，40ug SP-E2的IFN-r水平最低（P<0.0001），IL-4在体液免疫和适应性免疫上发挥作用，因此IFN-r的相似性的结果也在IL-4上得到体现。针对CSF设计的自组装纳米颗粒疫苗，IFN-γ与体内对病毒攻击的保护效果密切相关，特别是在早期[33,34]。这些发现证实了即使在低剂量下，SP-E2-mi3 NPs也比单体SP-E2表现出更好的保护免疫。

4. 讨论：

亚单位疫苗组成简单，可避免传统的全病原体抗原的不良反应。然而，既往研究表明，同源亚单位疫苗免疫可有效诱导主要的体液免疫反应，而不能诱导足够的细胞介导免疫反应，而这对保护细胞内病原体至关重要[35-38]。由于免疫原性较弱，仅含有亚单位疫苗的配方无法很好的适用于人类和其他大型动物。递送系统是研究有效疫苗的关键因素。事实上，越来越多的研究表明，自组装蛋白纳米颗粒（SAPN）作为递送系统促进了几种有效疫苗的研发。这些疫苗具有重复性抗原，同时实验结果证明，疫苗在抗体滴度和动物保护方面得到提高。基于自组装蛋白纳米的技术可以成为一种有效的战略，用于更快速生产和更广泛的有效疫苗，可以预防不断出现的病原体(如流感病毒、人类冠状病毒)[42-44]。大量研究表明，NPs可以作为有吸引力的支架，用于靶向显示免疫原性表位或蛋白质，以生成针对多种致病性感染的嵌合纳米疫苗。然而外来插入的片段大小是有限制的，更大的插入可能导致组装蛋白的稳定性，甚至导致自组装蛋白的无法形成。这些限制导致了基于NPS的疫苗的广泛应用。

实际上，很多自组装纳米颗粒疫苗已经被提出，包括病毒样颗粒，铁蛋白，胶囊等，通常，外源蛋白或者表位被融合进入纳米颗粒上，从而使得外源蛋白或者表位被展示及镶嵌在纳米颗粒上。为了保持自组装能力和NP的稳定性，这些纳米颗粒的所能容纳外源蛋白的能力仅为100 aa。因此，我们提出了一种自组装肽的疫苗设计策略。我们首先研究了插入片段大小的属性（抗原/表位大小）、NP的形成能力和NP的稳定性。不同的靶标蛋白范围从113aa-354aa，被串联到mi3上作为融合蛋白。所有的融合蛋白在体外均能自组装成均匀的纳米颗粒。除此之外，通过扫描电镜和动态光散射，我们可以确定外源基因融合到N端可以展示在骨架蛋白的外围。这与之前报道的mi3单体N端展示在外围是具有一致性的。

SP-E2作为候选疫苗中分子量最大的（高达354 aa）,被选为进一步研究的备选疫苗。

正如预期的那样，SP-E2-mi3自组装蛋白在25~65℃中表现出完美的稳定性。即使这些NPs在室温下保存4周后，仍能保存85%以上的NPs，并表现出较高的粒径均匀性和长期稳定性，由于该方案没有进行充分的优化，如果添加常见的稳定剂，例如山梨醇和海藻糖会使得聚合更小。该保护剂是否适用于SP-E2-mi3 NPs仍有待验证，目的是为了开发在生产、长期储存、运输和管理过程中具有可靠安全性和有效性的稳定疫苗配方。糖蛋白E2是CSFV主要的保护性抗原，位于病毒囊膜蛋白。E2在CSFV的外围展示和CSFV的病毒结构存在很大的相似性。这与反向疫苗学的一个重要原理是一致的，即成功的疫苗开发是基于整个病原体[49]中保守的表面暴露蛋白。这些结果表明，靶mi3 NPs可能是一种理想的纳米疫苗开发平台。

众所周知纳米颗粒粒径大小越接近病原体（10-200 nm）更加适合于APC细胞捕获同时促进APC的成熟，从而促进了适应性免疫的启动。与可溶性抗原相比，纳米颗粒递送的抗原能够增强APC的吸收和内化。同样的，TEM和DLS显示SP-E2-mi3纳米颗粒直径约为30nm，其中60个SP-E2-mi3单体形成统一的纳米颗粒，进一步的结果表明，SP-E2-mi3在100mM浓度时并没有明显的细胞毒性，同时也促进了APC抗原的捕获。更重要的是，与SP-E2相比，通过上调标记分子MHC II和共刺激分子（CD40、CD80和CD86），SP-E2-mi3更能促进DC的成熟。结果中，促炎细胞因子（TNF-a和IL-6）的表达得到极大的促进，而这在病毒清除和宿主免疫应答发挥着重要的作用。这些改进被认为能够促进抗原的交叉呈递，增强细胞内病原体的清除。

考虑到SP-E2-mi3 NPs具有良好的体外的疫苗性能，我们在小鼠模型上进一步评估了基于NP的CSFV疫苗的潜力。SP-E2-mi3免疫后的各项指标与之前的以NP为基础的疫苗免疫结果一致，说明了SP-E2-mi3促进了特异性免疫应答。体液免疫应答（CSFV特异性抗体和中和抗体）和细胞免疫应答（IFN-r和IL-4），与SP-E2相比，即使低剂量的SP-E2-mi3 NPs也能得到提升。有趣的是，针对mi3 NPs的抗体并没有干扰SP-E2的抗体产生，从而减少了骨架蛋白的潜在副作用。此外，mi3来源于人工合成自组装蛋白质分子，并不会引起任何副作用或安全问题。这一发现为基于np的策略比合理的亚单位疫苗具有更大的优势提供了支持证据，与单体抗原相比，低剂量的NPs可以诱导类似或更高水平的免疫应答[54,55]。

之前的文献表明，NP以特定的方向展示抗原，高密度的抗原列阵产生与BCRs的多次结合，这对高水平的中和抗体的产生起到至关重要的作用。自组装蛋白NPs靶向展示抗原及模仿了一种自然构象抗原，从而提高了疫苗效力，扩大对于多种疾病的功效。亚单位疫苗大多数进行两次免疫首免-加强策略，其中，首免和加强被给予同样的剂量和相同的免疫途径。大多数亚单位疫苗都需要进行多次免疫和大量抗原，这增加了疫苗接种的成本，特别是针对大型动物。这些发现表明基于NP递送系统能够克服传统疫苗的缺点，如细胞免疫差和多剂量。

尽管许多研究者认识到纳米颗粒呈递外源的抗病毒或者抗癌的疫苗的潜力，但是这个疫苗的实际有效性是我们不能忽视的重要因素。通过使用基因融合技术，SAPNs展示出超前的优势在与纳米颗粒连接效率及靶标抗原的包封方面（接近100%），而这些与疫苗的效力密切相关。然而靶抗原与纳米颗粒的N端或C端融合导致靶抗原在纳米颗粒的外围或者内部定位效果不同。基于SAPN的疫苗依赖于抗原的定向展示。mi3在这个研究中，目标抗原的融合在N端则展示在纳米颗粒的外表面，而C端融合则占据着纳米颗粒的内表面。之前的研究表明自组装AP205蛋白的末端是表面暴露的，尽管N端或者C端的融合对于抗原的展示外表面是影响不大的。但是铁蛋白的纳米颗粒，抗原融合在N端策略是展示在外表面的，PCV2 Cap蛋白（猪圆环2型帽子蛋白）或者HBC（乙肝核心抗原）SAPNs依赖于插入骨架蛋白主干的抗原。抗原与SAPNs的融合使得纳米颗粒疫苗的制作简化，并减少了工业生产的时间。使用自组装纳米颗粒疫苗的考虑的另一个因素是NPs的免疫原性。纳米颗粒蛋白不能或者诱导非常低的免疫反应。免疫原性强的NPs可能产生潜在的副作用或者抗NPs抗原的表位抑制。在我们的研究中，首次和增强后，SP-E2-mi3 NPs免疫小鼠后未观察到副作用和抗体感染。

值得注意是，基于SAPNs的疫苗受限于外源抗原的大小，由于空间位阻导致蛋白的折叠不当，超大的抗原融合往往会损害NPs的形成稳定性。已经应用了很多方法来绕开SAPNs的缺点。(Fe3O4和FeHA)纳米颗粒或金纳米颗粒(AuNPs)具有调节抗原递呈途径的能力，提供了一种后组装方式来装饰纳米颗粒外源抗原与赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸的化学偶联。聚乳酸共乙醇酸(PLGA)颗粒、多糖基NPs和聚酸酐基NPs也被用于包封高度保守的抗原并对疫苗接种进行评估。然而，由于严格的结合/包封条件和效率，这些技术可能导致疫苗的异质性。为了进一步拓宽SANPs在疫苗传递中的应用，新开发的SpyCatcher/SpyTag策略是一种新颖的、特异性的、自发的和不可逆的蛋白质偶联方法，通过SpyCatcher(蛋白质)与蛋白之间自发形成异肽键进行蛋白偶联SpyTag(肽)。该反应条件温和、定向，不需要化学偶联剂，可保持大抗原的自然结构[62]。因此，更全面地了解这些策略对于随时准备和合理使用SANPs以更有效地提供疫苗至关重要。

总之，我们开发一种基于mi3自组装的新型抗原递送系统。靶抗原与自组装肽骨架蛋白是一种基因融合形式，携带大尺径的外源抗原（高达354aa）能够自发自组装成稳定的NPs。由于mi3的N端是暴露在外表面的，所以N端插入的病毒抗原在NPs上实现了表面展示。SPE2-mi3 NPs表现出完美的热稳定性(25至65℃)和室温下的长期储存。此外，我们已经证明了利用该技术制备的CSFV E2疫苗增强了BM-DCs对抗原的吸收，上调了成熟和免疫刺激细胞因子的表达，促进了抗原的加工和交叉呈递。重要的是，与单体E2相比，纳米疫苗同时提高了CSFV特异性中和抗体和细胞免疫相关细胞因子(IFN-γ和IL-4)，这与对抗CSFV的体内保护效果密切相关。我们首次研究了纳米疫苗提高疗效的机制，并在小鼠模型上完成了疫苗试验。这种高度稳定和基于结构的自组装NP可以加速自组装纳米颗粒在纳米生物技术和疫苗开发中的广泛应用。