怎么检测腺相关病毒滴度？请收下这份protocol~

腺相关病毒滴度检测采用实时荧光定量PCR法：

滴度单位：vg/mL，指每毫升中含有的病毒基因组拷贝数。"vg"为Vector Genomes的缩写，指病毒基因组的数量。

I. 检测步骤

①使用DNase I 及蛋白酶K消化AAV病毒样品。

②稀释标准品质粒，设置标准品的拷贝梯度为105 、106 、107 、108 、109 、1010   。

③配置QPCR反应体系，每个样品和标准品设计3个复孔，进行QPCR反应。

II. 数据分析（以HBAAV2/9 -GFP 滴度测度为例）

①原始实验数据。Roche LC96 实时荧光定量PCR仪所测Ct值数据如下：

②标准曲线制作。以每组AAV标准品的Ct均值为纵坐标Y，其对应的拷贝数的对数为横坐标X，做标准曲线，得出标准曲线的函数公式及R平方值。

③待测样品滴度计算。将待测AAV样品Ct均值，代入②所得公式，计算所加入AAV模板拷贝数X，再换算成滴度。换算公式为：AAV病毒滴度= 10x ×400000（稀释倍数）vg/mL

对照病毒HBAAV2/9-GFP滴度=1.6×10^12 vg/mL

Q: 不同滴度测定方法有什么有优缺点？
A: pfu比较经典，但重复性不好，且检测时间周期长；efu简单耗时短，但需要穿梭质粒带荧光；TCID50可准确测定具有感染力的病毒滴度，检测周期适中；VI只能用于纯化后的病毒，检测颗粒数而不是活性病毒滴度。
Q：标准品的标准曲线公式中R2有什么作用？

A:R2代表相关系数，一般机器默认的是R2>0.99，这样才具有可行度和线性关系
Q: 保存过久的病毒需要重新检测滴度吗？
若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存，应尽快使用；如需长期保存则应放置于-80℃，如超过六个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。
Q: 腺相关病毒为什么不常使用PFU、TCID50等方式检测滴度？
A: AAV 感染不会导致细胞病变效应，因此，空斑实验不能用于确定其感染滴度，而TCID50法一般需要利用腺病毒作为辅助病毒，另一方面，常用的活性颗粒检测方法需要在细胞中检测，AAV基因的表达需要较长时间，检测效率低。基因组滴度以AAV衣壳中所含基因组含量作为定量依据，测定的是含目标基因组的AAV浓度，方法简单高效。