miRNA逆转录（茎环法）Protocol

以Chi-miR-204-3p为例

Mature sequence : GCUGGGAAGGCAAAGGGAC

换U为T，便于后续使用 : GCTGGGAAGGCAAAGGGAC

chi-miR-204-3p的后8位：AAAGGGAC

chi-miR-204-3p的后8位的反向互补序列 : GTCCCTTT

茎环引物序列： RT stem-loop primer 反转录用这个引物和U6下游引物

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacGTCCCTTT

反转录得到的cDNA链序列：

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacGTCCCTTTGTCCCTTTGCCTTCCCAGC

通过Primer5设计的引物：定量使用这对引物

q-chi-miR-204-3p-F: GCCCGGCTGGGAAGGCAAA

GCCCG（保护碱基）GCTGGGAA（结合位点）GGCAAA（位点后序列,挑选AT）

q-miRNA-unibersal-R2:CGCAGGGTCCGAGGTATTC   下游为通用引物 不必调换

RT-PCR：

下以PrimeScript™  RT  reagent  Kit (TaKaRa RR037A)为例：

取200ul 的 PCR 管，根据所得每组RNA 的浓度，每孔加入800ng 总RNA，计算出所需RNA 的体积。然后按TaKaRa 公司PrimeSriptTM RT Reagent Kit 建议的20μL 反应体系说明.

如果需要检测多个miRNA，则将miRNA和U6各自分开逆转录。

如果只检测单个miRNA，可在同一个逆转录体系中同时添加U6逆转录引物和茎环逆转录引物，同时逆转录。