运用经典的黄酮酚类靶向代谢组学探究对炭疽病的防治

前言

炭疽病菌于1882年由Penzig首次发现，主要分布在热带和亚热带地区。作为一种植物病原体，它可以引起多种木本和草本植物病害。严重制约了作物质量和产量的提高，造成了巨大的经济损失，油茶树种作为重要的木本油树种，受炭疽病影响，油茶树种子年产量减少20%-40%，严重者甚至减少80%，给当地林务员和油茶树企业造成重大损失。因此，挖掘抗病基因培育抗病品种是防治炭疽病最经济有效的措施。

2022年11月，由中国林业科学研究院亚热带林业研究所姚小华、卓仁英研究员课题组在Frontiers in Plant Science期刊（IF:6.627）发表了题为 “Overexpression of dihydroflavonol 4-reductase boosts flavonoid production involved in the anthracnose resistance ”的研究成果，通过靶向代谢组学研究方法，发现了CoDFR在植物炭疽病抗性中特征，为类黄酮介导的防御机制的关键作用提供了理论依据。

中文标题：二氢黄酮醇4-还原酶（CoDFR）的过表达促进炭疽病抗性中黄酮的产生

研究对象：油茶

发表期刊：Frontiers in Plant Science

影响因子：6.627

发表时间：2022年11月

合作单位：中国林业科学研究院亚热带林业研究所

运用生物技术：靶向代谢组学

研究思路

研究方法

1. 研究材料/实验分组

(1) 培育油茶'CL150'（抗性系）和'CL102'（感敏系）2年生扦插苗

(2) 共4个处理组（CL150CK、CL150T、CL102CK和CL102T），每个处理组每个时间点重复3个生物学重复。

2.研究方法

（1）实时荧光定量 PCR （qRT-PCR） 分析

（2）亚细胞定位和过表达分析

（3）靶向代谢组分析：UPLC–质谱/质谱分析

研究结果

1.光孢子虫感染后油茶叶片生理特性的变化

为探究光孢子虫感染过程中油茶叶片的生理反应，本研究在12、24、48、72、96和120 hpi采集的不同样品中测定了MDA含量，测定了CAT、POD和SOD活性。总体而言，CL102T（接种CL102）中的MDA含量显著高于CL150T（接种的CL150）（P<0.05）（表S2;图1A）。耐油茶和易感品系的CAT活性增加。其中，CL102T在72 hpi时达到215.01U•g，明显高于CL102CK。CL150T在72 hpi时达到356.22U•g，明显高于CL150CK（表S2）。发现CL150T中的CAT活性高于CL102T，CL150CK和CL102CK中的CAT活性，并且在整个实验过程中略有变化（图1B）。在12 hpi时，CL102T和CL150T中的POD活性显著高于CL102CK和CL150CK（表S2;图 1C）。在48 hpi时，CL150T的POD活性最高（29.67U•g），显著高于CL102T（26.91U•g）。在CL150T和CL102T中，POD活性的最大值为48 hpi，48 hpi后下降。

在所有时间点，CL150T中的POD活性都高于CL102T（图1C）。在72 hpi时，CL150T叶片SOD活性达到94.53U•g的峰值，显著高于CL150CK的活性。CL102T在72 hpi时SOD活性达到峰值72.25U•g，CL150T叶片SOD活性是CL102T的1.34倍。CL150T中的SOD活性显著高于CL102T（表S2;图 1D）。

图1 | 测量不同时间点的生理指标

2.油茶抗病易感系黄酮含量估算

为了确定类黄酮在抗性和敏感性系中的积累，作者以3dpi测量了油茶叶片中的类黄酮含量。CL150T中的黄酮含量为54.51 mg/g，CL102T中的黄酮含量为47.54 mg/g。CL150T中原花青素B1、原花青素B2和原花青素B3的含量分别为204.49、54.68和107.22μg/g，而CL102T中的这些值分别为86.21、9.31和36.59μg/g（表1）。CL150T中TF、TP、原花青素B2和原花青素B3含量显著高于CL150CK。相比之下，CL150T中原花青素B1的含量低于CL150CK中。

表1 | 不同处理的黄酮含量

3.耐药油茶CoDFR的分离和序列分析

CoDFR的全长CDS序列为1044 bp，编码347个氨基酸（图2A）。为了进一步探索CoDFR的进化关系，运用不同植物物种的DFR氨基酸序列构建了系统发育树。结果表明，CoDFR序列与切基安戈莱奥萨的DFR具有最高的同源性（~79%）（图2B）。

图2 | （A）CoDFR的CDS和氨基酸序列；（B）CoDFR的系统发育树分析；

4.CoDFR基因在耐药油茶中的组织特异性表达模式

CoDFR的表达从0逐渐增加到96 hpi，并且明显高于对照组（0 hpi）（图3A）。同时，对不同油茶组织中CoDFR的表达（图3B），发现CoDFR在叶芽中的表达水平明显高于叶、茎和根。

图3 | CoDFR基因在耐药油茶中的组织特异性表达模式

（A） CoDFR 在果糖衣原体感染期间不同时间点的相对表达分析

（B） CoDFR 在抗病系中的组织特异性表达分析。

误差线表示来自三个生物重复±SD。“*”表示与WT的显著差异（p<0.05），“***”表示与WT的显著差异（p<0.005）。

5. CoDFR的亚细胞定位

CoDFR蛋白定位到内质网（ER）由亚细胞定位预测网站:在线预测。

为了确定CoDFR的亚细胞定位，将含有CoDFR：GFP（绿色荧光蛋白）融合构建体的根癌曲霉细胞悬浮液注射到烟叶中。如图4A所示，控制RFP（mCherry的红色荧光蛋白）信号分布在ER和细胞膜中，游离GFP信号出现在细胞核，细胞膜和细胞质中，信号分散在整个细胞中。同时，ER标志物和CoDFR-GFP共定位在ER和细胞膜中（图4B），表明CoDFR在ER中发挥其功能。

图4 | CoDFR的亚细胞定位

（A）对照，EV-GFP和内质网标志物（35S：EV-GFP）；

（B）CoDFR，35S：CoDFR-GFP和内质网制造者融合蛋白（35S：CoDFR-GFP）；

白色箭头显示描述的位置

6.识别过度表达的烟草株系

为了揭示CoDFR的功能，通过CoDFR的异源表达产生了转基因烟草系。在潮霉素选择培养基上筛选13个独立的转基因烟草系，并通过qRT-PCR分析测定所有株系中CoDFR的相对表达水平。根据结果，选择了三个CoDFR表达较高的转基因系（D4，D11和D12系）进行后续分析（图5A）。为了评估转基因烟草是否具有更高的抗病性，用炭疽病菌接种了五周龄的烟草叶片。有趣的是，在转基因叶上观察到轻微的坏死病变，与接种后4天野生型（WT）叶上出现的严重疾病症状形成鲜明对比（图5B）。

图5 | 识别过度表达的烟草株系

（A）CoDFR在转基因烟草植株中的相对表达水平，红框表示相对表达较高的3个转基因烟草系。

（B）果果菌感染后转基因烟草的表型，比例尺为0.5厘米。

7.烟草中CoDFR的过表达增强了对炭疽病感染的抵抗力

转基因烟草上的疾病斑点明显小于WT上的疾病斑点（图6A）。为了进一步研究CoDFR的过表达是否促成了黄酮类化合物的积累，作者首先估算了转基因烟叶中的黄酮含量。发现转基因D4，D11和D12系中的类黄酮含量显著高于对照（WT），分别增加了3.89，4.07和4.24倍（图6B）。

此外，作者评估了黄酮生物合成途径基因在96 hpi下感染果糖梭菌的转基因烟叶中的表达。结果表明，在CoDFR过表达的烟叶中，参与类黄酮途径的所有基因的表达均发生改变。NtCHS上调了2.38倍、2.74倍和4.24倍;NtCHI在D4、D11和D12中分别上调了5.01、2.54和3.08倍。NtF3'H、NtF3'5'H、NtF3H、NtDFR、NtLAR和NtFLS的表达倍数变化分别为0.34-1.83、3.76-4.29、1.00-4.71、5.61-8.26、1.24-4.65和0.68-1.04。NtANS、NtANR和NtGT表达分别增加了5.65~6.47、6.21~8.56和1.99~4.09倍（图6C）。

图6 | CoDFR的过表达增强了对炭疽病感染的抵抗力

（A）果果孢杆菌感染后疾病斑点大小的统计分析；

（B）转基因烟草中的黄酮含量；

（C）参与类黄酮生物合成途径的关键基因的表达水平；

星号表示与WT的统计学显著差异（“*”P < 0.05）；

8.CoDFR过表达促进了烟草中黄酮类化合物的积累

为了探索过表达系中类黄酮物质积累的变化，研究使用UPLC-ESI-MS/MS靶向代谢组学研究对130多种类黄酮进行了绝对定量。在野生型和CoDFR过表达系（D4、D11和D12系的等量混合）中共鉴定出65个黄酮类化合物，其中31个上调，12个下调，22个不变（差异倍数为≧2或≦0.5作为筛选标准。详情见表S3）。此外，46种类黄酮衍生物在CoDFR过表达系中的积累更高（图7A;表 S2）。与对照组相比，山奈酚、槲皮素、槲皮素、柚皮苷、根皮苷和槲皮素-3-半乳糖苷等主要类黄酮的水平同时增加了14.82倍、8.24倍、6.82倍、2.03倍、5.83倍和1.52倍（图7B;表 S3）。有趣的是，过表达系的水杨酸较高，但水杨素含量低于WT（图7C）。

图7 | 靶向代谢组学研究烟草中黄酮类化合物变化

（A） 65 种类黄酮的热图可视化。每种黄酮的含量按行归一化；

（B） 表达CoDFR的烟草中不同黄酮类化合物的含量；

（C） 表达CoDFR的烟草中的水杨酸含量；

“*”表示与WT有统计学意义的差异（P < 0.05）。

研究结论

研究发现接种后感病油茶叶片黄酮含量增加。抗性油茶树品种的CoDFR的表达与光孢子虫侵染的时间进程呈正相关。烟草中CoDFR的过表达增加了水杨酸含量，调节了黄酮通路相关基因的表达，促进了黄酮的积累，从而增加了炭疽病的抵抗力。

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