5分+干湿结合！化疗耐药+预后模型+单细胞分析，不蹭爆火热点也能发SCI ！

Hi, 还在为没有文章而发愁吗？快来生信鸟公众号看看吧！生信文章大家都了解过，生信热点大家都一直关注吗？手握生信热点、了解创新思路，会让SCI向你招手！闲话少说，想找什么热点，想看什么思路，快来找生信鸟吧！

今天布小谷就推荐一篇文章，小伙伴们可以收藏这个不怕撞车的新路子——耐药+干湿结合！即包含了部分实验，又突破了常规思维，瞬间提升文章质量！（ps：没有思路，不知道怎么创新的快来找生信鸟，超多创新思路供你选择哦！）具体怎么操作，下面听布小谷娓娓道来~ ~

布小谷推荐的这篇文章，研究内容具有较高的创新点（化疗耐药）（ps：内容选的好，很容易达到出其不意的效果哦），研究思路亮眼，结合单细胞数据分析，并且又有大量外部数据集进行验证，而且再加上外部实验验证（PCR+WB+CCK-8）。整个文章数据量不仅大而且创新性很高，5+的文章手到擒来！（ps：还没有思路吗？还在为创新点苦思冥想吗？快来找生信鸟吧！）

l题目：通过综合分析和实验验证胰腺癌化疗耐药相关预后基因特征的鉴定

l杂志：Frontiers in Oncology

l影响因子：IF=5.738

l发表时间：2023年5月

研究背景

化疗耐药是改善胰腺癌(PC)预后的主要障碍。化疗耐药是多因素的，是胰腺癌细胞、肿瘤干细胞和肿瘤微环境相互作用的结果。然而，更多的胰腺癌患者将受益于精准治疗和靶向药物。因此寻找新的无创性生物标志物对于PC患者早期诊断和及时治疗是非常必要的。

数据来源

研究思路

根据来自Cancer Therapeutics Response Portal (CTRP v2)的吉西他滨敏感性数据，共有30个PC细胞系被分型。随后鉴定了吉西他滨耐药细胞和吉西他滨敏感细胞之间的差异表达基因(DEGs)。这些与预后价值相关的上调DEGs被纳入癌症基因组图谱(TCGA)队列的LASSO Cox风险模型。来自GEO的4个数据集(GSE28735、GSE62452、GSE85916和GSE102238)被用作外部验证队列。然后，根据独立的预后因素制定nomogram。采用“oncoPredict”方法评估多种抗PC化疗药物的疗效。使用“tcgabiollinks”包计算肿瘤突变负荷(TMB)。使用“IOBR”包进行肿瘤微环境(TME)分析，使用TIDE和“easy”算法评估免疫治疗效果。最后通过RT-qPCR、Western blot和CCK-8检测验证ALDH3B1和NCEH1的表达和功能。

主要结果

1.耐吉西他滨PC细胞系中DEGs上调

对CTRP数据库中的数据进行Z-评分。由于在7个细胞系(PANC0403、PATU8988S、PANC0813、PANC1、CAPAN1、MIAPACA2和SUIT2)中观察到类似的反应，因此选择0.5和-0.5作为分组阈值。在30个PC细胞系中，13个被分类为吉西他滨耐药，7个被分类为中度吉西他滨耐药，10个被分类为吉西他滨敏感(图1A)。差异表达分析显示，17个基因在吉西他滨耐药组的表达水平明显高于吉西他滨敏感组(图1B, C)。

2. 通过RNA-seq和scRNA-seq检测吉西他滨化疗耐药相关预后基因的表达水平

通过K-M分析得出，与吉西他滨化疗耐药相关的17个DEGs中有6个在TCGA队列中具有预后价值，其中ALDH3B1和NCEH1的生存曲线如图2A。（ps：生存分析也可以用布小谷推荐的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据就而已自动出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）6种预后DEGs在TCGA肿瘤样本中的表达水平明显高于未匹配GTEx正常样本(图2B)。一致地，这些基因在耐吉西他滨的PC细胞系中比在正常胰腺细胞系中表达得更高(图2C)。然而，匹配的肿瘤组织与正常组织比较表明，EGFR在恶性组织中没有相对上调(图2D-F)。

经质控，GSE212966正常/肿瘤细胞数为10751/17338,CRA00160正常/肿瘤细胞数为13771/34974。在单细胞水平上，与ALDH3B1、EGFR、ERAP2、MSLN和NCEH1相比，肿瘤细胞表达CHST11水平较低(图3A-E、4A-E)。如UMAP图所示，大多数星状细胞和成纤维细胞来自肿瘤样本(图3A-C, 4A-C)。单细胞分析进一步证实了大量RNA-seq分析中EGFR的相对低表达(图3D, 4D)。然而，在肿瘤组织的恶性成分和间质成分中，它仍然是上调的，这证明了它对肿瘤的进展是不可或缺的(图3E, 4E)。与CRA00160的结果相比，GSE212966中ERAP2的平均UMI计数在肿瘤样本中较低，这可能是由于检测到的恶性细胞比例较低(图3A-D)。（ps：这里就凸显了作者分析思路的逻辑性与创新性、通过RNA-seq和scRNA-seq检测吉西他滨化疗耐药相关预后基因的表达水平，大量数据集进行探究，文章质量瞬间提升，感兴趣的小伙伴欢迎借鉴复现呦！）

3. 化学耐药相关基因标记的开发和验证

除CHST11外，其他5个化疗耐药相关基因均纳入预测TCGA训练队列OS的LASSO Cox模型(图5A、B)，风险评分公式为:风险评分= (0.3731 * EGFR表达)+ (0.2364 * ERAP2表达)+ (0.1588 * MSLN表达)+ (0.1254 * NCEH1表达)+ (0.2233 * ALDH3B1表达)。根据TCGA队列患者的中位风险评分，将所有入组患者分为高危组和低危组。K-M分析和风险图显示，风险评分较高的患者预后明显较差(图5C、D)。TCGA、GEO和全队列的Log-rank检验P值均小于0.001。TCGA组的1年、3年和5年生存率预测精度分别为0.750/0.781/0.741,GEO组为0.596/0.615/0.755，全组为0.653/0.668/0.765(图5E)。风险评分与5个基因的表达水平呈正相关(图5F)。（ps：这里的验证样本数量比较大，也是近期文章发高分的一个助力点，验证队列较多，并且结合湿实验，是未来生信研究的一个趋势）

4. 化学敏感性分析

由于5个预后基因在耐吉西他滨PC细胞系中高度表达，因此，这一已建立的基因标记是一个非常有希望的PC患者吉西他滨敏感性指标。后续分析结果显示风险评分随着吉西他滨耐药评分的增加而增加，低风险组对吉西他滨更敏感(图6A-D)。由于该基因标记与吉西他滨敏感性密切相关，我们进一步探索了其在预测其他常用抗PC药物反应方面的潜力。如图6E所示，风险评分较高的患者更容易对阿霉素、奥拉帕尼、紫杉醇和FOLFRINOX成分(氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂)产生耐药。

5. 免疫浸润及免疫治疗敏感性评价

综合7种已发表的方法(CIBERSORT、MCPcounter、EPIC、xCell、quantiseq、TIMER及 ssGSEA算法)，综合评价TCGA和GEO队列中PC患者的TME组成。风险评分与支持免疫抑制的细胞呈正相关，包括髓源性抑制细胞(MDSCs)、调节性T细胞(Treg)、癌症相关成纤维细胞(CAFs)和辅助T型2 (Th2)细胞(图7A)。与此一致的是，高风险组的抗癌细胞，如CD8+ T细胞、细胞毒性细胞和效应记忆T (Tem)细胞明显较低(图7B)。应用TIDE方法估算ICB耐药评分，结果显示低危组对ICB治疗更为敏感(图7C)     

6. PC细胞功能丧失实验

RT-qPCR分析表明，ALDH3B1和NCEH1在三种PC细胞系(AsPC-1, CFPAC-1, 和PANC-1)中的表达水平相对高于正常胰腺上皮细胞系(hTERT-HPNE)(图8A, C)。转染后48小时, siRNA的沉默效率较高(图8B, D)。CCK-8增殖实验显示，敲除ALDH3B1和NCEH1后，PC细胞株的增殖率明显降低(图8E)。吉西他滨细胞毒性实验表明，敲低ALDH3B1和NCEH1增强了吉西他滨的敏感性(图8F)。值得注意的是，这种效应是浓度依赖的。CFPAC-1/AsPC-1/PANC1细胞活力差异的浓度阈值为0.01/0.1/10。这些发现表明，NCEH1和ALDH3B1是PC细胞增殖和吉西他滨敏感性的关键调节因子。（ps：这里就用湿实验进行验证，用正常胰腺上皮细胞系和三株胰腺癌细胞系进行对比，验证两个预后基因的表达。通过转染实验，敲低两个预后基因的表达量，进行细胞增殖实验和药物敏感性实验的探究，是文章的又一亮点，感兴趣的小伙伴可以进行相关实验的设计哦！

文章小结

在这篇文章忠，在化疗耐药+多数据集验证+单细胞数据分析+湿实验是文章的突出亮点，非常加分。同时免疫细胞浸润+免疫治疗使得创新性再次提升。本文在疾病选择、分析思路和验证实验设计上都有比较高的创新性，并且有大量的数据集进行验证，使得文章的质量有很大的提高！有兴趣的小伙伴快点收藏，认真学习呦！