免疫细胞生信正值当打之年！利用单细胞分析获取“NK细胞”相关基因，疾病分型+常规预
免疫细胞相关生信还有什么新的切入点吗？
我关注的疾病CAF、TAM、T细胞都有人做了，还能做啥呢？
免疫细胞那么多，还有B细胞、NK细胞、MDSC都可以考虑呀，T细胞还有很多亚型也可以试试，创新性都很不错哦！
今天我们来聊聊NK 细胞，它们的数量在人体循环淋巴细胞中占比 5-20%！NK 细胞和T细胞一样，都具有杀伤癌细胞、感染病毒细胞等病原体的能力，在我们的免疫系统中扮演着非常关键的角色。
话说现在NK细胞免疫疗法相当火热了，但基本上都是在做临床和基础实验，可还有很多小伙伴没有实验条件或者急需文章，不怕，这时候就该请出咱们“生信”大佬出手啦！
目前利用NK细胞相关基因特征做生信暂时还比较少，那么这波入手NK细胞生信绝对是个良机~
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那么NK细胞怎么做生信？首先要拿到NK细胞相关的基因集合，有几种方法，比如数据库下载、文献整理、免疫浸润+WGCNA以及单细胞数据分析等等。
小云今天就分享一个利用单细胞数据分析获取NK细胞相关基因的思路，疾病分型+经典预后模型构建套路，用上NK细胞基因特征就可以轻松拿下6分+纯生信，超高性价比，一起来看看吧！
题目：揭示以自然杀伤细胞为主的免疫异质性对肝细胞癌的预后和治疗意义
杂志：Computers in biology and medicine
影响因子：6.698
发表时间：2023年4月
研究思路
利用TCGA-LIHC数据集进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，以鉴定NK细胞标记基因(NKGs)，并发现了80个与预后相关的基因。基于预后NKGs, HCC患者被分为两种不同临床结果的亚型。随后，对预后NKGs进行了LASSO-COX和逐步回归分析，以建立5个基因的预后特征- NKscore。综合描述了NKscore分层的两个危险组的不同突变状态。此外，所建立的NKscore相关nomogram具有较强的预测性能。通过单样本基因集富集分析(ssGSEA)揭示肿瘤免疫微环境(TIME)的情况。T细胞受体(TCR)库、肿瘤炎症特征(TIS)和免疫表型(IPS)分析揭示了两个NKscore风险组之间免疫治疗敏感性的差异。
主要研究结果
1. 利用单细胞数据（scRNA-seq）数据鉴定HCC中的NK细胞标记基因（NKGs）
分析scRNA-seq数据集评价HCC-TME中细胞亚群的多样性。利用全局标度归一化方法LogNormalize对每个细胞的mRNA表达进行归一化，然后进行高变量基因的鉴定。使用“clustree”函数确定了合适的聚类值(图1A)。参考CellMarker数据库将细胞标注并分类为恶性细胞、内皮细胞、NK细胞、T细胞、髓细胞源性细胞等(图1B)。热图显示了前四个标记基因在不同细胞类型中的平均表达水平(图1C)。tSNE图还显示了NK细胞中排名前四位的标记基因的表达水平(图1D)。通过将“FindAllMarkers”函数整合到“Seurat”中，获得265个NK细胞标记基因。
（ps：单细胞分析可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据一键出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html ）。
图1. scRNA-seq分析用于鉴定NK细胞标记基因(NKGs)
2. 聚类分析：根据预后NKGs识别出两种NK亚型
作者采用“multi-split”方法筛选了80个与预后显著相关的NKGs，随后通过共识聚类方法将其用于识别两种HCC亚型。图2D的热图显示了80个NKGs在两种NK亚型HCC患者中的表达，并标注了多种临床特征(肿瘤负担、分期、分级、BMI、种族、性别和年龄)。3D-PCA图显示了两种亚型HCC之间的差异(图2E)。两种NK亚型在OS、DFS、PFS和DSS方面存在明显差异，亚型2患者的生存结局比亚型1更差(图2F-I)。
图2. 预后NKGs的鉴定和共识聚类
3. 肝癌NK亚型的临床意义及生物学功能
作者分析了两种亚型HCC患者中多种临床特征的比例，亚型2的晚期患者比例明显更高 (图3A)。然后筛选两种亚型之间的DEGs，对DEGs进行GO和KEGG富集分析，富集项大多与免疫相关(如T细胞激活、Th17细胞分化等)，表明两种亚型之间免疫微环境的差异(图3B和C)。接着进行GSVA和GSEA分析，结果显示，在亚型1的TME中，干扰素等多个炎症相关通路显著富集 (图3D和E)。
图3. 肝细胞癌NK模式的临床意义及分子特征
4. 两种NK亚型均表现出不同的TME特征
作者使用ESTIMATE算法计算了ImmuneScore、StromalScore、ESTIMATEScore和TumorPurity，发现亚型1的间质和免疫细胞浸润明显增高，肿瘤纯度较低，提示亚型1的HCC患者TIME状态呈阳性，预后较好(图4A-D)。亚型1显示出相对较高的TIP评分(图4E)。此外，亚型1患者的细胞溶解评分较高（ps：细胞溶解评分是由颗粒酶A (GZMA)和穿孔素1 (PRF1)的表达水平计算得出的指标，主要由效应细胞毒性T细胞和NK细胞分泌）(图4F)。
图4. 肝癌NK亚型的免疫特征
5. 预后NK评分系统的构建与评价
为了建立可靠准确的基于NKGs的预后预测工具，作者采用TCGA训练集，这5个NKGs中UBB、CIRBP、GZMH为保护基因，NUDC、NCL为危险基因（图5A）。根据NKscore的中位值将HCC患者分为两组不同危险程度的患者，PCA图显示两组患者在转录组上存在明显差异(图5B)。HCC患者NKscore值的分布、OS状态以及5个NKscore基因的表达谱如图5C所示。Kaplan-Meier生存分析显示低风险组患者OS状态较好，tROC曲线显示NKscore预测1、3、5年OS的准确性较高(图5D、E)， PFS、DFS、DSS生存分析显示低风险组患者预后较好(图5F-H)。
图5. 基于TCGA训练数据集的HCC NK评分系统(NKscore)构建与评估
而且NKscore优于其他已发表的HCC特征和已知的生物标志物(图6D-F)。分析证明了NKscore的稳健性和准确性。
图6. NKscore与其他已发表的HCC特征/标志比较
6. 构建nomogram
基于NKscore、分期和肿瘤负荷，构建了一个综合预后nomogram来预测HCC患者的1-、3-和5年OS(图7C)。校准曲线显示，nomogram预测的3年和5年OS与观测的OS之间具有良好的一致性(图7D)。此外，nomogram诊断为高危的HCC患者临床预后较差（图7E），tROC曲线显示nomogram在预测1年、3年和5年OS方面具有极好的准确性(图7F)。nomogram与肿瘤负荷、分期及其组合相比，c指数也最高，表明其准确性最高(图8G)。
图7. 建立nomogram并评价
7. NKscore与HCC的TIME特征显著相关
采用ssGSEA分析HCC患者28种浸润免疫细胞的分布(图8A)。相关分析(图8B)和差异分析(图8C)分离出与NKscore相关的17种免疫细胞类型，其中15种重叠(图8D)。接下来，作者对NKscore与多种免疫功能进行相关性分析。如所示，发现NKscore与细胞周期等几种免疫治疗预测通路呈显著正相关（图8E和F）。
图8. NKscore与TME特征的相关性
8. NKscore预测HCC的治疗反应
分析HCC患者的TCR库，低NKscore风险组的TCR丰富度和多样性明显更高，表明他们具有更大的肿瘤免疫潜力(图9A)。此外，低风险组患者的TIS评分明显较高(图9B)，免疫治疗反应的指标IPS在低NKscore风险组中也更高，表明低NKscore风险组的患者对免疫治疗的反应可能更好(图9C)。
为了进一步研究NKscore是否可以更直接地预测免疫治疗的反应，作者将IMvigor210队列分为NKscore高、低风险组，生存分析显示低风险组患者的OS更好(图9D)。IMvigor210队列的SD/PD组和来自GSE126044的无应答组具有更高的风险评分(图9E-F)。此外，箱线图显示10种常见的化疗/靶向治疗药物在两个危险组中的效果不一致(图10G)，提示NKscore在临床应用中对化疗/靶向药物的选择具有潜力。
总结
这篇文章是利用单细胞数据分析获得了NK细胞相关基因，然后基于NK细胞相关基因进行疾病分型+构建风险预后模型，虽然整体内容没有脱离常规预后模型分析套路，但用上“NK细胞”这一切入点后，身价倍增，文章分数蹭蹭上涨，丝毫不逊色于前段时间比较火的CAF和TAM！并且相较于前2个方向，NK细胞目前的生信发文量还不多，属于黄金抢发期，感兴趣的小伙伴赶快分析起来吧。
如果你还苦恼于生信分析没有思路，或者嫌分析方法太过简单、太过老套，想要创新思路的，或者对NK细胞等热点方向感兴趣的小伙伴快来联系小云吧！
