宏基因组学习日志—2022.6.28

一．什么是宏基因组

某一特定环境中的所有物种的基因信息总和称为宏基因组。

二．宏基因组来源

土壤微生物、肠道、胃液、粪便、食物等

三．宏基因组研究方向及应用

研究方向：1.物种鉴定（物种组成及丰度）；2.功能鉴定（群落结构和功能对比分析）；3.物种间代谢网络（阐释物种间的代谢网络，发现阐释物种间的代谢网络，发现具有应用价值的代谢产物）；4.菌种和功能基因检出（对特定生境中起关键作用的菌种和功能基因的检出）；5.单菌组装（宏基因组binning进行单菌基因组组装）

应用：1.医学领域：致病菌研究；疾病标志微生物筛查；疾病的诊断和分型；微生物与疾病关联；

2.农学领域：生物防治；植物与微生物互作；动物发育与免疫；

3.工业领域：食品发酵；污染修复；污水处理；

4.环境领域：生物地球化学循环；抗生素抗性基因；水体、空气污染；

四．对宏基因组测序技术的介绍

宏基因组测序（Metagenomic Sequencing）:指利用二代或三代测序技术对环境样品中全部微生物的基因组DNA进行序列测定，以分析微生物的遗传多样性和丰度，解读微生物群体的基因组成和功能多样性，探索微生物与环境及宿主之间的关系，发掘和研究新的具有特定功能的基因等。

五．宏基因组实验流程

 1. 提取样品总DNA；2.DNA质量检测；3.核酸片段化；4.末端修复及3’端加上突出的A尾；5.连接测序接头；6.磁珠法筛选片段；7.PCR扩增（ONT无）；8.上机测序；

六．宏基因组binning分析

宏基因组分箱（Binning） 是将宏基因组测序得到的混合了不同微生物的序列reads或序列组装得到的contigs或scaffolds按物种分开归类的过程。这些分开归类的序列被称为宏基因组组装基因组（metagenome-assembled genomes，MAGs)。

七．常见分析类型

1.物种/功能组成分析：展示每个样品中有哪些物种/功能，在不同处理中变化趋势

2.物种/功能多样性分析：

2.1 Alpha多样性反映的是单个样品物种丰度（richness）及物种多样性（diversity），有多种衡量指标：Chao 1、Ace、Shannon、Simpsom。

2.2 Beta多样性反映的是样品或者不同处理间差异，结合相似性分析（ANOSIM）或者置换多因素方差分析（Permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA或者ADONIS分析）来检验组间（两组或多组）的差异是否显著大于组内差异，分析不同分组因素对样品差异的解释度。

3.物种/功能差异分析：差异分析可用于比较不同处理间物种、功能、代谢产物的差异，包含两组间T-test、Metastats分析、Wilcoxon等，多组间Anova、LefSe分析、Kruskal-Wallis等。

4.相关性与关联分析：可用于研究微生物、功能、环境因子和代谢产物之间的相互作用关系，有两类方法，一种是排序分析（RDA/CCA、db-RDA）,一种基于相关系数的方法（Pearson、Spearman、Sparcc），展现形式可以分为热图、网络图等。

5.随机森林与ROC分析：基于菌群和代谢物数据的随机森林模型可有效识别不同处理间生物标记物（biomarker），结合预测模型的ROC曲线，筛选在不同处理间起重要作用的微生物、功能及代谢产物。