USP17通过去泛素化AEP抑制肿瘤发生和肿瘤生长

写在前面

        今天推荐的是由上海交通大学医学院在2019年1月29日发表于International Journal of Biological Sciences（2020IF：6.58，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Ying ying Lin教授，研究表明USP17通过去泛素化AEP抑制肿瘤发生和肿瘤生长。

研究背景

        泛素特异性蛋白酶17(USP17)是去泛素酶的新成员，据报道在几种实体瘤中发挥重要作用。然而，USP17在乳腺癌肿瘤发生中的表达和功能仍然不明确。

摘要部分

        在这里作者发现乳腺癌组织中USP17的mRNA水平低于正常组织。同时，与恶性细胞系MDA-MB-231相比，在正常上皮细胞MCF-10A和MCF-7中检测到更高的USP17水平。在MCF7细胞中抑制USP17增强了肿瘤发生和肿瘤生长，而USP17在恶性MDA-MB-231细胞中的过度表达降低了其体外和体内的肿瘤发生和生长能力。进一步的研究表明,USP17与天冬酰胺内肽酶(AEP)相互作用并去泛素化，导致AEP的蛋白质水平降低。此外，AEP的敲低通过ERK信号的失活在体外和体内抑制了乳腺癌肿瘤的发生和生长。总之，作者的研究表明USP17去泛素化AEP，下调其蛋白质水平，并通过干扰ERK信号传导抑制乳腺癌肿瘤发生。因此，作者的数据表明USP17是乳腺癌的潜在肿瘤抑制因子，而AEP是乳腺癌治疗的有前景的靶标。

研究内容

1.USP17表达在乳腺癌中下调

        首先，作者使用GEPIA数据库分析了USP17在1085例乳腺癌组织和291例正常乳腺组织中的表达水平。结果表明正常组织中的USP17 mRNA水平高于乳腺癌组织。使用来自UALCAN的TCGA数据获得了类似的结果。此外，作者发现与正常组织相比，乳腺癌组织各个阶段的USP17 mRNA表达均降低，这表明乳腺癌中USP17的表达与疾病进展阶段呈负相关。此外，作者通过Broad-Novartis癌细胞系百科全书(CCLE)数据库发现一组乳腺癌细胞系中的USP17 mRNA表达完全不同。接下来，作者检测了USP17在不同恶性程度的不同乳腺癌细胞系中的表达。有趣的是，USP17的mRNA和蛋白质水平在MCF-10A和MCF-7中高于MDA-MB-231细胞（一种恶性乳腺癌细胞系）。

研究结论：USP17在乳腺癌肿瘤发生中起着至关重要的作用。

2.USP17表达的变化改变了乳腺癌细胞在体外和体内的生长情况

        为了研究USP17在乳腺癌中的功能，作者构建了USP17过表达MDA-MB-231细胞系和USP17敲低MCF-7细胞系。然后，作者探究了USP17是否影响体外乳腺癌细胞的细胞生长能力。根据生长曲线结果，作者发现与对照细胞相比，MDA-MB-231中过表达的USP17显着抑制细胞生长。相反，与对照细胞相比，USP17敲低显着增强了细胞生长。接下来，作者评估了USP17对体内乳腺癌细胞致瘤性的影响。将USP17-OEMDA-MB-231细胞、USP17-KDMCF-7细胞及其对照细胞注射到BALB/c裸鼠脂肪垫中。经过4周，USP17-OEMDA-MB-231细胞显示出降低的肿瘤生长能力，而MCF-7-KD细胞具有明显更高的致瘤性。

研究结论：USP17在乳腺癌细胞中具有肿瘤抑制功能。

3.USP17与AEP相互作用并使其去泛素化

        AEP可以被TRAF6泛素化并被USP17去泛素化。为了进一步研究USP17对AEP的调节，作者进行了免疫共沉淀(IP)分析以确认AEP和USP17的相互作用。将编码AEP、Flag标记的TRAF6和Flag标记的USP17的质粒共转染到293T细胞中。然后用AEP抗体免疫沉淀细胞裂解物。蛋白质印迹分析显示TRAF6和USP17均存在于AEP复合物中。随后通过尺寸排阻色谱法发现，AEP、USP17和TRAF6出现在同一复合物中。此外，免疫荧光染色分析显示AEP和USP17共定位于细胞的细胞质区域。总之，这些数据表明AEP与USP17相互作用。为了确定USP17的去泛素化功能，作者将编码AEP、泛素(Ub)、TRAF6、USP17和USP17-C89S的表达载体共转染到293T细胞中。用蛋白酶体抑制剂MG132处理后，细胞裂解物用AEP抗体免疫沉淀。TRAF6过表达显着增加了AEP泛素化水平，而USP17（而不是无活性突变体USP17 C89S）的过表达显着减弱了AEP泛素化。

研究结论：AEP和USP17之间具有相互作用，USP17从AEP中去除泛素链。

4.USP17下调AEP蛋白水平

        先前研究表明RAF6可以增加AEP的稳定性和分泌，作者想探究USP17是否调节AEP的稳定性和分泌。用TRAF6、USP17和USP17 C89S转染编码AEP的质粒后，作者分析了AEP的表达水平。TRAF6过表达显着提高了pro-AEP和活性AEP水平，而USP17过表达降低了两种形式的AEP表达。有趣的是，USP17突变质粒C89S对降低AEP蛋白水平没有影响。作者用Flag-USP17表达质粒转染293T细胞并通过蛋白质印迹分析。结果显示，随着细胞中表达更多的USP17，AEP表达逐渐降低。由于成熟的AEP可以分泌到培养基中，为了探索USP17对AEP分泌的调节，作者检测了来自USP17-OEMDA-MB-231和对照细胞的细胞培养基中的AEP水平。蛋白质印迹结果显示当USP17过表达时AEP分泌显着减少。为了确定USP17对AEP稳定性的调节依赖于其去泛素化酶活性，作者进行了q-RT-PCR测定，结果发现USP17和C89S突变体的过表达都不影响AEP mRNA水平。一致地，USP17敲低几乎没有改变AEP mRNA水平。

研究结论：USP17下调了翻译后途径中的AEP蛋白水平。

5.在体外和体内抑制AEP可减少肿瘤发生和肿瘤生长

        AEP参与肿瘤侵袭和转移进程。最近，有研究报道核质钙通过AEP调节细胞增殖。为了进一步研究USP17是否通过下调AEP抑制乳腺癌肿瘤发生，作者在MDA-MB-231细胞系中构建了AEP敲低稳定的乳腺癌细胞系。AEP敲低细胞中的pro-AEP显着降低。并且AEP的敲低显着降低了体外细胞生长。此外，使用含有不同AEP蛋白浓度的培养基处理MDA-MB-231细胞，作者发现含有较高AEP蛋白浓度的上清液显着促进了MDA-MB-231细胞体外生长。细胞周期分析也表明，在AEP沉默的细胞中，G2/M中的细胞比例显着减少。此外，作者将AEP KD和含有绿色荧光蛋白（GFP）的对照MDA-MB-231细胞接种到裸鼠脂肪垫中，以研究AEP在原位乳腺癌模型中的作用。与对照组相比，接种AEP敲低细胞的小鼠的肿瘤形成率和肿瘤体积要低得多。此外，作者进行了回补实验以确认USP17和AEP在体内乳腺癌肿瘤发生中的功能。由USP17过表达引起的肿瘤生长显着减少可以通过AEP过表达来恢复。

研究结论：AEP在肿瘤发生和肿瘤生长中起重要作用，USP17通过下调AEP水平抑制乳腺癌增殖。

6.USP17抑制AEP介导的ERK信号激活

        为了确定USP17和AEP如何调节乳腺癌的增殖，作者探究了AEP蛋白处理的MDA-MB-231细胞中的几个重要信号通路。Western blot检测表明，在AEP刺激后，p-ERK，但不是总ERK，急剧增加。同时，USP17过表达和AEP敲低都导致p-ERK水平下降。因此，作者的结果表明，AEP通过激活ERK信号促进乳腺癌，而USP17通过下调AEP蛋白水平抑制乳腺癌的增殖。

研究结论：作者表征了USP17的肿瘤抑制功能和AEP在乳腺癌细胞中的肿瘤促进功能。USP17通过去泛素化并增强AEP转换来抑制乳腺癌增殖。此外，AEP促进乳腺癌细胞增殖部分依赖于ERK信号的激活，而USP17的功能是破坏这一过程。

结论与讨论

        总之，作者的数据表明USP17在乳腺癌样本和细胞系中被下调。USP17通过去泛素化AEP并维持AEP蛋白水平,在体内和体外抑制乳腺癌细胞的生长和增殖。在正常细胞中，由于USP17水平高，AEP蛋白维持在低水平。然而，在USP17下调后，AEP在乳腺癌细胞中过度表达。

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原文链接：https://www.ijbs.com/v15p0738.htm