去泛素化酶USP20通过稳定SNAI2促进乳腺癌转移

写在前面

        今天推荐的是由普林斯顿大学分子生物学系在2020年8月7日发表于GENES & DEVELOPMENT（2020IF：11.360，JCRQ1）的一篇文章，通讯作者是Yibin Kang教授，研究表明去泛素化酶USP20通过稳定SNAI2促进乳腺癌转移。

研究背景

        SNAI2（也称为SLUG）是SNAIL家族转录因子的三个成员之一，通过增强细胞迁移和侵袭来促进癌症转移，促进转移细胞的存活，并增强乳腺癌干细胞的活性。在许多癌症类型中观察到SNAI2表达升高，并且与转移和术后复发风险增加以及各种癌症患者的生存期缩短相关。

摘要部分

        SNAI2/SLUG是一种促进转移的转录因子，是一种不稳定的蛋白质，可通过泛素蛋白酶体降解系统进行降解。在这里，作者使用包含65个基因的人类DUBcDNA文库和包含98个基因的siRNA文库进行了全面的功能增益和功能丧失筛选，并将USP20鉴定为一种可调节SNAI2泛素化和稳定性的去泛素化酶(DUB)。USP20的进一步研究证明了其在促进乳腺癌迁移、侵袭和转移方面的作用。USP20与乳腺肿瘤样本中的SNAI2蛋白水平呈正相关，较高的USP20表达与ER-乳腺癌患者的不良预后相关。

研究内容

1.SNAI2调节DUB的鉴定     

        为了鉴定可能去泛素化和稳定SNAI2的DUB，作者在人类DUB siRNA文库进行筛选。作者在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中进行了siRNA筛选，该细胞系具有相对较高的内源性SNAI2表达。选择最显着降低SNAI2水平的前20个DUB基因敲低进行第二轮筛选。在这20个候选中，两个基因USP20和USP52的敲低导致SNAI2蛋白水平与对照相比降低到不到一半。

        为了补充siRNA文库筛选，作者还通过免疫共沉淀筛选了DUBcDNA文库，以检查每个DUB与SNAI2的相互作用。这些DUB中的每一个都与SNAI2在293T细胞中共同过表达。使用HA抗体拉下DUB进行共免疫沉淀（co-IP）实验，并在co-IP样品中探测SNAI2。65个DUB被HA抗体成功拉下，其中包括USP20在内的20个DUB显示出与SNAI2的相互作用。本研究的重点是USP20，这是基于这两种筛选重叠的最有希望的候选药物。

研究结论：作者使用包含65个基因的人类DUB cDNA文库和包含98个基因的siRNA文库进行了全面的功能增益和功能丧失筛选，并将USP20鉴定为可以与SNAI2作用的最有希望的候选药物。

2.USP20通过去泛素化SNAI2抑制SNAI2降解

        作者进一步研究了USP20在调节SNAI2稳定性方面的作用。首先，作者证实SNAI2蛋白水平的降低不是由于SNAI2 mRNAs的下调。接下来，作者测试了USP20是否可以去泛素化SNAI2。收集蛋白质样品前用MG132处理细胞6小时，以抑制蛋白酶体降解，从而积累多泛素化SNAI2并在以后检测。拉下内源性SNAI2蛋白，使用抗泛素抗体检测多泛素化SNAI2。当USP20被敲低时，观察到SNAI2的多聚泛素化水平更高。在稳定过表达SNAI2的MDA-MB-231细胞中也进行了类似的泛素化测定。只有野生型USP20而非催化失活突变体USP20-C154S的过表达降低了SNAI2多泛素化。总之，这些泛素化分析表明USP20是SNAI2真正的去泛素化酶。由于多泛素化SNAI2被蛋白酶体靶向降解，作者通过放线菌酮(CHX)追踪试验测试了USP20敲低对SNAI2降解率的影响。细胞有无CHX(50μg/mL)处理以抑制新的蛋白质合成，随后通过蛋白质印迹确定CHX处理后剩余的SNAI2水平。与泛素化分析结果一致，野生型而非催化失活突变体USP20的过表达稳定了SNAI2，而USP20敲低导致SNAI2降解加速。

研究结论：USP20通过去泛素化SNAI2来稳定SNAI2。

3.USP20敲低通过减少SNAI2抑制迁移和侵袭

        作者敲低了LM2，SCP28和SUM159-M1a细胞中的USP20。正如预期的那样，在敲除USP20后SNAI2蛋白水平降低，且这种效应是SNAI2特有的。另一方面，野生型USP20而非催化失活突变体USP20-C154S的表达增加了过表达SNAI2的LM2细胞中的SNAI2水平。众所周知，SNAI2可促进细胞迁移和侵袭。为了测试USP20是否可以通过靶向SNAI2来调节迁移和侵袭，作者进行了Transwell迁移和侵袭试验。当使用siRNA在SCP28细胞中敲除USP20或SNAI2时，与用对照siRNA处理的细胞相比，迁移的细胞数量显着减少。使用高度转移性LM2细胞的侵袭测定观察到类似的结果。与SNAI2敲低细胞类似，与对照细胞相比，USP20敲低的细胞显示出显着较低的侵袭能力。重要的是，SNAI2过表达完全恢复了USP20或SNAI2敲低对侵袭的影响，表明USP20对迁移和侵袭的影响是由SNAI2介导的。对照、USP20和SNAI2敲低LM2细胞的微阵列分析显示，许多迁移/侵袭相关基因在USP20和SNAI2敲低细胞中显示出一致的变化，表明USP20和SNAI2在调节迁移和侵袭方面具有相似的下游效应子。

研究结论：USP20敲低通过减少SNAI2来抑制细胞侵袭。

4.USP20敲低抑制乳腺癌细胞的肺转移

        鉴于SNAI2在转移中的重要作用，作者接下来研究了USP20对乳腺癌细胞肺转移的影响。首先，作者使用含有USP20靶向shRNA的慢病毒生成了具有稳定USP20敲低的细胞系。首次生成细胞系时，SNAI2的蛋白质水平降低。然而，USP20敲低细胞中的SNAI2蛋白水平在多次传代后恢复，这可能是细胞发展了补偿机制以重新获得SNAI2表达。因此，作者使用两种不同的siRNA敲低USP20，证实siRNA敲低效果至少持续10天，这足以进行体内实验肺定植研究。萤火虫荧光素酶标记的siRNA转染的SUM159-M1a和LM2细胞被静脉注射到NSG小鼠中，并使用生物发光成像(BLI)监测它们在肺中的转移性播种和生长。注射后五天，与对照细胞相比，USP20或SNAI2敲低细胞在肺中接种的癌细胞数量已经显着减少。在4周后处死小鼠并计数肺上的转移结节。在USP20和SNAI2敲低组中观察到的肺转移结节明显减少，这可能是由于肺播种减少以及增殖适度减少所致。

研究结论：USP20敲低抑制了乳腺癌细胞的肺定植，从而减少了转移结节的形成。

5.USP20与临床乳腺癌样本中的SNAI2呈正相关

        因为在ER乳腺癌患者中，较高的SNAI2 mRNA水平与较差的预后相关，作者将临床研究重点放在ER乳腺癌患者上。作者首先使用在线Kaplan-Meier绘图仪工具在大型公共临床微阵列数据库中测试了 USP20 的预后价值。USP20 mRNA的较高表达与较差的无转移存活相关，这与作者在小鼠中观察到的USP20促进转移一致。作者使用TCGA-BRCA样本集在ER-乳腺癌患者的mRNA水平上测试了USP20和SNAI2之间的相关性。在USP20和SNAI2 mRNA表达之间没有观察到显着相关性。为了确定USP20在蛋白质水平上是否与SNAI2相关，作者接下来收集了84名ER-乳腺癌患者的乳腺癌样本，并使用IHC染色检查了SNAI2和USP20蛋白质水平。发现这两种蛋白质表达模式显示出显着的正相关。重要的是，正如它们的促转移功能所预期的那样，乳腺癌组织中较高的USP20和SNAI2蛋白质水平与乳腺癌患者的无复发生存率和无转移生存率较差相关。作者对乳腺癌患者样本中的USP20和SNAI2的研究证明了USP20具有良好的临床相关性。因此，作者的发现提供了一种新的潜在治疗选择，通过间接抑制蛋白酶USP20来降低乳腺癌患者的SNAI2水平。

研究结论: USP20与临床乳腺癌样本中的SNAI2呈正相关。

结论与讨论

        尽管转录因子SNAI2在调节乳腺癌转移方面发挥着关键作用，但目前还没有直接靶向SNAl2的药物。由于DUBs比SNAl2本身更容易制成药物，识别和稳定SNAI2的DUBs可以作为降低SNAI2水平和抑制肿瘤进展的新药物靶点。在这里，作者对siRNA和cDNA文库进行了全面筛选，并确定USP20是真正的SNAI2稳定DUB，可促进乳腺癌细胞迁移、侵袭和转移。

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原文链接：https://genesdev.cshlp.org/content/34/19-20/1310