核酸的显示方法Feulgen反应和Brachet反应

DNA的细胞化学- -- Feulgen 反应

实验目的

了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法

实验原理

DNA是由许多单核背酸合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基构成=DNA经1mol/L盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的第-碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反，生成紫红色化合物。

实验仪器、材料和试剂

显微镜，恒温水浴锅.温度计.解剖针.酒精灯.试管.烧杯、载玻片.盖玻片、吸水纸洋葱鳞茎或根尖

1mol/L盐酸的配制:取82.5ml密度1.19g/ml的浓盐酸加蒸馏水至1000ml

Schiff 试剂的配制及保存:称取0.5g碱性晶红加入到100ml煮沸的蒸馏水中(用三角烧瓶)，时时振荡，继续煮5min (勿使之沸腾) ， 使之充分溶解.然后冷却至50°C时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1M HCI,冷却至25°C时，加入0.5g Na2S2Os (偏重亚硫酸钠)，充分振荡后，窘紧瓶塞，在室温暗处静置至少24h (有时需 2-3d) .使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5个活性埃粒，用力振荡1min.最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色也无沉淀，贮于4"C冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠或钾，便之再转变为无色时，仍可再用.

亚硫酸水:取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1M HCI,三者使用前混匀。

方法与步骤:

1、将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1mol/L HC中，加热到60°C水觶8-10min

2、蒸馏水水洗

3、Schiff试剂避光染色30min

4、用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，

每次1min

5、水洗5min

6.将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片.

7.显微镜检查

对照片

方法一:先将材料放在5%三氣乙酸中90°C水浴15min,主要把DNA抽提掉，然后按步骤1-7制片观察。

方法二:材料不经水解，直接染色， 制片观察。

RNA的细胞化学- Brachet反应

一、实验目的.

了解Brachet反应的原理，掌握有关的操作方法。

二、实验原理

甲基绿一派洛宁(methyl green-pyronin)为碱性染料,它能分别与细胞内的DNA、RNA结合而呈现不同颜色。当甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿和染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色:派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择结合显示红色其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用，同时两种核酸分子都是多聚体，而其聚合程度有所不同。甲基绿易与聚合程度高的DNA结合呈现绿色。而派洛宁则与聚合程度较低的RNA结合.呈现红色，但解聚的DNA也能和派洛宁结合呈现红色，即RNA对派洛宁亲和力大，被染成红色，而DNA对甲基绿亲和力大,被染成蓝绿色

三.实验材料

洋葱鳞茎表皮

四、仪器和试剂

显微镜、冰箱、天平、量筒、表面皿、裁玻片、盖玻片、探针.镊子.洗瓶.吸水纸等。1、Unna试剂:甲基绿派洛宁染色液

甲液: 5%派洛宁水溶液6ml

2%甲基绿水溶液6ml

蒸馏水16ml

乙液: 1mol/L 乙酸缓冲液( pH4.8)16ml

甲乙两液分别置4C冰箱备用，用时甲乙两液混匀。

2. 1mol/L乙酸缓冲被(pH4.8) 配方:

A液:冰醋酸6m加蒸馏水至100ml

B液:乙酸钠13.5g加蒸馏水 至100ml

取A液40ml+ B被60ml混匀即为pH=4.8

配制注意事项:①Pyronin可加热助溶。②Methyl green批号不同，染色效果差别很大。商品Methyl green常混有甲基紫，影响染色效果，应先把药品放在分液漏斗中，加入足量的氯仿，用力振荡，然后静置，直到洗脱甲基紫为止,最后干燥备用。

五、实验内容和方法

1.用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块，置于载玻片上。

2.滴一滴Unna试剂，染色30min 。

3.蒸馏水洗两次，吸水纸吸去多余水分。

4.盖上盖玻片,镜检

对照片

1.撕取洋葱鱗茎内表皮，经5%三氯乙酸90C水浴处理15min，再经70%乙醇洗片刻，然后按步骤1- 4制片观察.

2.撕取洋葱鳞茎内表皮，用0.1%RNA酶室温处理10-15min "蒸馏水洗，吸干，然后按步骤1-4制片观察。

六、实验作业及思考题

绘图细胞中RNA和DNA的分布

七、补充资料

1.在植物花粉形成过程中，花药内的一些细胞分化成小孢子母细胞(2n) ，每个小孢子母细胞进行二次连续的细胞分裂(第- -次减数分裂和第二次碱数分裂)

 每个小孢子母细胞产生四个子细胞，每个子细胞就是一个小孢子。小孢子内的染色体数目是体细胞的一半。

2.在适当的时机采集植物的花蕾，经固定. 染色、压片后，就可以在显微镜下观察到细胞的减數分裂。整个过程可分为下列各个时期:

(1) 间期: DNA复制

(2)第一次减数分裂(RDI)

前期II:染色质浓缩卷曲成染色体状态，核仁、核膜消失。

中期II:染色体排列在赤道板上，每个染色体含有一个着丝粒.两条染色单体。两条染色单体开始分离。此时细胞的染色体数为n.每个染色体有两条染色单体

后期I:着丝粒一分为二，姊妹染色单体分离，向两极移动.

末期II:染色体解螺旋变为染色质状态，核仁.核膜重现，胞质分裂，各形成两个子细胞.

3.实验关键:供试材料大想花序的准备及处理方法，待早春3-4月大葱花序长到颜色呈绿色时，直接采摘花序后放在卡诺液中固定24小时，再放入95%、80%酒精依次脱水，最后换70%酒精放在冰箱4°C长期保存，取材时期是影响整个实验成败的关键。