文献解读｜肾透明细胞肿瘤三级淋巴结构产生抗肿瘤活性的浆细胞并促进其传播

期刊：Immunity  43.47分

技术：单细胞转录组测序；单细胞VDJ测序；bulk 5’RNA测序；空间转录组测序；多重免疫荧光

导语

目前有初步研究表明肿瘤内三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures，TLS）和患者的良好预后以及癌症免疫疗法响应相关。也有文献研究表明TLS的作用机制和B细胞的免疫响应有关，但二者作用方式尚不明确。因此，本文使用空间转录组学来检测肾透明细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）中TLS和B细胞关系。结果显示B细胞在TLS中富集，并且证实在TLS中B细胞逐渐向浆细胞转变（plasma cell，PC）。分析显示TLS中免疫细胞展示更多的克隆多样性，选择性和扩展性。在TLS+肿瘤中，PC会分泌更多IgG和IgA，且沿成纤维细胞轨道分布在肿瘤内部。IgG和恶性肿瘤细胞调亡相关，预示TLS参与抗肿瘤效应，并且和免疫治疗有效响应相关。

研究结果

1. 空间转录组分析肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）架构揭示TLS+肿瘤中富集B细胞

为了分析TLS对TME整体结构的影响，实验人员使用了来自10×Genomic的空间转录组产品Visium。在24 例ccRCC原发肿瘤上进行了空间转录组，分别为新鲜组织的冷冻包埋样本（fresh frozen，FF，n = 12）和FFPE样本（n = 12）。每个肿瘤组织TLS的定位由训练有素的病理学家注释分段并通过H＆E染色后呈现（图1A）。图1分别展示了冰冻包埋样本TLS+肿瘤（图1A -1C）；FFPE样本TLS+肿瘤（图1D -1F）；和冰冻包埋样本TLS-肿瘤（图1G -1H -1I）。通过对比可以发现，在TLS结构中B细胞系、单核细胞系、纤维细胞的标志物检出率高，但是中性粒细胞和内皮细胞标志物则相反，而冰冻包埋样本和FFPE样本针对以上结论一致。

2. 免疫球蛋白（Ig）对应基因在TLS中的表达情况

为了进一步确定TLS在肿瘤中的转录特征，结合H&E，免疫荧光（CD3/CD20/PD-1），免疫组化（CD3/CD20）等标签分别对冰冻包埋组织和FFPE组织进行区域划分，根据划分好的区域进行TLS和肿瘤区域间转录组差异基因的对比。AUC达到0.7且至少出现3例TLS+肿瘤的基因作为TLS特征，筛选了29个基因作为TLS分子标志物，该分子特征包括12个免疫球蛋白基因（IGHA1, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHGP, IGHM, IGKC, IGLC1, IGLC2, IGLC3, and JCHAIN）， 5个B细胞分子标记（CD79A, FCRL5, MZB1, SSR4和XBP1）， 2个T细胞标记 （TRBC2 和 IL7R），2个成纤维细胞标记物（CXCL12, LUM)），2个补体蛋白编码基因（C1QA和C7）， 除此外还有基因：CD52、APOE、PTLP、PTGDS、PIM2和DERL3。这29个基因的标记，可以作为TLS的分子标志物， 标志物在冷冻样本（AUC：0.89 - 0.97）和FFPE样本（AUC:0.75 - 0.93）中均呈现出TLS特异性（图2F-2H）。值得注意的是，TLS虽然富集B细胞标志物，但是初始B细胞相关的表达缺乏（图2D）；而FCRL4+记忆B细胞(p = 2e-16)，发生中心B细胞(p = 0.0087)和浆母细胞(p = 2e-16)相关表达比较高。

3. 空间之别B细胞受体(BCR)分析原位高频克隆型

本文使用了开源的分类工具MiXCR，从bulk 5’RNA测序数据以及Visium 3’RNA 数据中分析BCR中的 IgL和IgH克隆型及其胚系躯体细胞的超频突变。这些数据能够获得足够长度的mRNA转录本，以覆盖大多数IGL和一些IGH序列及其完整互补决定区域（CDR）3。在TLS区域也发现了数量占比最多的轻链克隆型（图3A）。通过测量轻链序列中V区突变数与胚系V区基因进行比较，从而评价B细胞的成熟程度。轻链V基因突变中位数在TLS区域显示低至中位水平，而在肿瘤区域远离TLS的位置显示比较多高突变序列（图3B）。但是从全长角度考察TLS区域有比较高的突变率，且主要为躯体细胞突变（图3C）。就TLS占比进行对比，TLS占比高的肿瘤组织的其高频突变更多，无论是VL区域基因（TLS高-中位数= 12个突变，TLS低-中位数= 8个突变，p = 0.0163）还是VH区域基因（TLS高-中位数= 19个突变，TLS低-中位数= 13.5个突变，p= 0.0227）（图3D）。

根据bulk 5’RNA-seq结果，除了突变频率更高，TLS占比高的样本其整体克隆型的种类多，且克隆型的数量大。为了分析克隆型间的关系并对其进行可视化，根据VH-CDR3序列进行计算并用环形树状图展示，对于TLS+肿瘤（id: b_1）。一共有31个克隆家族，其中2 ~ 16分别只识别出唯一克隆型（图3F）。而在个别家族中，有些克隆型可以被检测到80次，甚至20次（图3F）。通过Visium结果证明TLS附近聚集的是同一个克隆家族，而在TLS远处稀疏散布，主要展示的是IgH家族1群和3群(图3G)。

4. 浆细胞从TLS沿成纤维细胞轨迹传播

为了分析肿瘤内浆细胞和成纤维细胞的位置以及原位CXCL12（细胞趋化因子）的表达，本文使用多重免疫荧光标记FFPE肿瘤切片，利用作为浆细胞标记物（MUM1和IRF4）和成纤维细胞标志物COL1 (Col1a)加以区分。TLS区域利用CD3/CD20显色标记（图4A），可以看到MUM1+ IgG+浆细胞和少量MUM1+ IgA+浆细胞这两种双阳的浆细胞分布在TLS区域。同时在区域上COL1+/CXCL12+成纤维细胞在这些区域与MUM1+ 浆细胞定位相同（图4B）。此外，浆细胞沿着沿着成纤维细胞的轨迹分布，浆细胞分布上嵌入 COL1+ CXCL12+成纤维细胞构成的网格中，且主要在TLS的远端(图4C)。

从放大的图片观察如图4所示，以细胞核检测定位来判断COL1+成纤维细胞定位（图4D-4E-4H-4I）。绝大多数的浆细胞都非常贴近成纤维细胞核的位置。从展示的两例肿瘤组织来看，平均距离分别为17.5 μm和19 μm，其距离分布如图4G和4K所示。同时也针对其余在44个肿瘤样本上进行测量，其平均距离为25.7 μm的距离（图4L）。

5. TLS和分泌IgG的浆细胞参与肿瘤细胞调亡过程，并影响免疫疗法疗效

利用多色荧光标记FFPE肿瘤组织中未成熟TLS，CD20+ B细胞（绿色），CD23+滤泡树突状细胞（红色），BCL6+ 发生中心B细胞（白色），PNAd+ 高内皮小静脉（黄色）（图5A）。为了进一步研究TLS与肿瘤内浆细胞的关系，首先需要分析TLS成熟度。成熟的 TLS的特征：发生中心（germinal center，GC）包含一个被T细胞包裹的B细胞区域，其中包括了CD4+ PD1+ T细胞，CD4+ PD1+CXCR5+ Tfh细胞和分泌CXCL13的细胞（图5B）。GC区域具体细胞分布特征：CD23+滤泡树突状细胞（FDC）， BCL6+ CD20+ B细胞，分布边缘的PNAd+高内皮小静脉（图5C）。结合Ig相关的检测，统计结果显示肿瘤中TLS的存在与MUM1+ IgG+的分泌密度之间存在显著的正相关（图5D）。同时发现含有TLS的CD23+ FDC、BCL6+细胞、PNAd+ 高内皮小静脉三者与MUM1+IgG+ 浆细胞和MUM1+IgA+ 浆细胞密度之间存在很强的相关性（图5E）。

值得注意的是，以CAIX+作为肿瘤细胞膜的标记，在TLS+肿瘤能观察到IgG，但是在TLS-中没有观察到（图6A）。随后在103例肿瘤组织中检测，结果显示TLS+的肿瘤中IgG的检出率到100%，二者的正向相关性与和TLS-的肿瘤对比达到显著差异（p=0.0046）（图6B）。此外，发现了肿瘤细胞IgG标记和肿瘤中浸润的MUM1+IgG+浆细胞有显著性正相关（中位IgG标记MUM1+IgG+高肿瘤= 80%，和MUM1+IgG+低肿瘤= 40%，p =0.000195）（图6C），而IgA和IgG的表达趋势一样但是IgA本身的表达量比较低（图6D）。为了揭示肿瘤结合IgG抗体的作用，本文还针对肿瘤细胞发生凋亡的现象进行研究， 通过细胞调亡典型形态学改变如细胞核变大等， 并且使用cleaved caspase 3作为调亡的蛋白标志物。图 6E表明cleaved caspase 3主要在TLS+的肿瘤中。而cleaved caspase 3高表达的区域同时伴随IgG的表达，二者的染色重叠覆盖度达到60%（图6E和6F）。除了以上的共定位结果，通过免疫荧光标记也发现CD68+巨噬细胞也会聚集到以上的产生调亡的肿瘤细胞附近（图6G）。

为了检测IgG对于接收免疫抑制剂疗法患者的影响，采集了患者的信息，并且选择IgG 60%作为分界点，对患者队列进行分类。结果显示高表达IgG的患者PFS更长(中位数 PFS = 16.3月vs 6.4月, p=0.039)（图6H和6I）；而这群高表达IgG的患者中针对免疫疗法的客观响应率（objective responses,OR ）也更高（图6J）。

参考文章：

Meylan M, Petitprez F, Becht E, et al. Tertiary lymphoid structures generate and propagate anti-tumor antibody-producing plasma cells in renal cell cancer. Immunity. 2022;55(3):527-541.e5. doi:10.1016/j.immuni.2022.02.001