南京大学运用GC-MS非靶向代谢组学增强水稻抗盐性和抗瘟性研究
前言
种子发芽是影响作物产量和品质的关键阶段。在气候变化的情况下，种子将更频繁地暴露在各种恶劣环境（高温、干旱、洪水和盐碱）和土传播疾病中，这可能导致发芽减少和活力丧失，威胁种子发育并影响作物产量。因此，寻求提高种子抗逆能力的策略（在胁迫条件下快速发芽和建立幼苗）对于保持作物产量至关重要。
2023年1月10日，南京大学环境学院赵丽娟研究团队在ACS Nano期刊（ IF:18.027）发表了题为“AgNPs-Triggered Seed Metabolic and Transcriptional Reprogramming Enhanced Rice Salt Tolerance and Blast Resistance”的研究成果，文章采用多组学（代谢组学和转录组学）联合研究方法，研究银纳米颗粒（AgNPs）在对种子进行预刺激后，探索种子应激恢复力的影响。结果表明，AgNPs启动触发了水稻种子中的代谢和转录重编程，激活应激信号和防御相关通路，并启动了应激/免疫反应。促进种子在胁迫条件下更快，更好地发芽，提高幼苗对生物和非生物胁迫的抵抗力。文章提出的基于纳米生物刺激剂的策略有望促进可持续农业。
中文标题： AgNPs诱发的种子代谢和转录重编程增强水稻抗盐性和抗瘟性
研究对象：水稻
发表期刊：ACS Nano
影响因子：18.027
发表时间：2023年01月10日
合作单位 : 南京大学
运用组学技术：GC-MS非靶向代谢组学、转录组学
研究背景
植物已经进化出复杂的防御系统来应对各种非生物和生物胁迫，这种能力可以通过压力/免疫刺激来增强。使用预刺激，可以预先调节植物非生物胁迫/免疫系统，从而在随后的非生物和生物胁迫下更快，更强烈地激活防御反应。
银纳米颗粒（AgNPs）已被证明可以催化ROS的产生， 所以AgNPs被选为纳米生物刺激剂来启动种子防御系统。此外，水稻作为世界各地的主要食物来源，极易受到盐胁迫的影响，尤其是在幼苗早期。因此，选择水稻和盐胁迫作为植物和非生物胁迫条件。
作者证明AgNPs可以被种子吸收，随后在种子中触发代谢和转录组重编程。负责应激信号传导的特殊代谢物的水平在AgNPs干预后增加。转录组学分析表明，AgNPs激活信号传导和防御相关基因表达，表明应激/免疫反应的激活。重要的是，这种“压力记忆”可以持续到幼苗阶段，表明种子防御-启动能够同时增加幼苗对非生物和生物胁迫的抵抗力。总的来说，这种简单的基于纳米生物刺激剂的策略可能有助于设计气候适应型作物。
研究思路
研究结果
1. 盐胁迫下AgNPs预处理种子增强种子活力
为了测试AgNPs是否可以在发芽阶段增加耐盐性，在没有AgNPs的情况下,暴露于盐中的水稻种子在发芽速度，发芽百分比，幼苗活力指数，生物量和根长方面表现出显著降低（图1A-F），证明了对盐胁迫的敏感性。相比之下，用AgNPs预灌水的水稻种子具有更快的种子发芽速度，增加发芽率，种子活力指数，增加生物量和根长（图1A-F）。这些结果验证了AgNPs引发可以增强水稻种子耐盐性的假设。这些结果显示，使用AgNPs作为纳米生物刺激剂在不利条件下提高种子性能的巨大潜力，而潜在的机制仍有待完全阐明。
图1 | AgNPs启动可增强盐胁迫条件下种子的萌发和活力
a) 7日龄水稻幼苗的代表性图像；
b) 发芽速度；
c) 发芽率；
d) 种子活力；
e) 生物量；
F) 根长；
2. AgNPs在干预过程中进入种子
推测AgNPs增强种子对盐胁迫耐受性的机制是由AgNPs触发的“防御启动”效应。为了验证这一假设，作者首先测试了AgNPs在启动过程中是否以及如何进入种子。将用AgNPs引发24 h的水稻种子彻底洗涤并分成三个隔室（种皮，胚胎和胚乳），并通过ICP-MS进行银含量分析。结果表明，在种子的所有组织中均检测到Ag（图2A）。表明AgNPs（或Ag离子）可以穿透种皮并进入种子组织。SP-ICP-MS的结果进一步表明，种子中的所有Ag均为纳米颗粒形式（图2B），表明纳米颗粒Ag而不是电离的Ag进入种子（图 2F）。
3. 种子中的AgNPs催化ROS生产
接下来，为验证种子中的AgNPs是否可以催化ROS的产生。使用2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为荧光探针，分别通过荧光显微镜和生物阅读器可视化和定量水稻种子中的ROS。荧光显微镜图像显示，与水启动相比，AgNPs引发明显增加种子ROS水平，特别是在胚胎组织中（图2C）。这些结果表明，AgNPs提高了水稻种子的ROS产量。体外纳米酶测定发现AgNPs可以在酸性条件下在H2O2存在下催化TMB（3，5，3′，5′-四甲基联苯胺，底物）的氧化（图2D）。通过使用电子顺磁共振（EPR）波谱，作者进一步证实了AgNPs产生的ROS物种是OH•（图2E）。综上所述，结果表明AgNPs能够参与H2O2催化和OH•生成。因此，细胞中的AgNPs可能模仿POD酶的功能，调节ROS稳态。
图2 | 在AgNPs启动过程中，种子中AgNPs和AgNPs增强ROS的吸收
a) 用AgNPs灌注24 h后水稻种子不同组织（种皮，胚胎和胚乳）中的银分布；
b) 用AgNPs引发24小时的水稻种子中纳米颗粒Ag的大小分布；
c) 使用荧光（左）和明场（右）显微镜捕获的水或AgNPs引发的水稻种子的图像；
d) AgNPs的类似POD的活动；
EPR结果显示羟基自由基（OH•）的产生；
4. AgNPs引发的水稻种子的代谢变化
羟基自由基被称为信号分子，在促进发芽、免疫反应和适应非生物胁迫方面发挥重要作用。AgNPs可能作为激活应激/免疫反应的警告信号，包括防御相关基因和代谢物的激活。因此，接下来使用多组学分析（代谢组学和转录组学）表征了AgNPs触发的种子分子变化。
首先，使用基于GC-MS非靶向代谢组学测定AgNPs或水干预24 h的水稻种子中代谢物。如图3A所示，OPLS-DA评分图表明两组之间有明显的分离。这表明AgNPs-启动在启动24小时内显著改变了水稻种子的代谢物谱。换句话说，AgNPs引发导致水稻种子中的代谢重编程。
AgNPs增加了参与应激信号转导的几种代谢物的水平。例如，水杨酸（SA）是一种信号分子，可激活对非生物和生物胁迫的防御反应，AgNPs的种子中证明了SA水平的增强（图3C）。SA在建立系统性获得性耐药性（SAR）中起重要作用。因此，ROS触发的SA上调可能是促进水稻种子发芽和耐盐性的原因。综上所述，这些信号分子的上调可能是AgNPs启动触发水稻种子免疫反应的有力指标。总之，这些结果表明，24小时的AgNPs引发在水稻种子中引起了显著的代谢重编程。
图3 | 用AgNPs引发水稻种子的代谢变化
a) 基于用水（水底漆）或AgNPs灌注的水稻种子代谢组学数据集的OPLS-DA评分图；
b) OPLS-DA VIP评分图，显示导致分离的代谢物；
c) 箱线图表示用40mg / LAgNPs处理的水稻种子中显著变化的代谢物（通过t检验筛选）的相对丰度，蓝色、粉红色、黄色和紫色意味着糖、抗氧化剂、莽草酸途径中间体和信号代谢物。
5. AgNPs引发的水稻种子的转录变化
代谢组学分析揭示了AgNPs引发的水稻种子中的一些关键分子事件，这可以部分解释水稻种子耐盐性增强的原因。接下来使用转录组RNA测序（RNA-seq）分析了AgNPs引发的水稻种子的转录组，以揭示更多负责增强水稻种子耐盐性的分子事件。RNA测序表明在AgNPs启动过程中水稻种子的转录组谱发生显著改变。此外，使用KEGG数据库的通路分析显示，多达20条通路上调（图4）。这表明ROS作为外部信号在水稻种子中诱导了明显的防御反应，这证实了上述基于代谢组学数据的假设。
应激反应由受体激活和细胞信号传导引发。作者发现，与对照相比，在用AgNPs引发的水稻种子中，许多与激素信号转导相关的基因上调（图5）。AgNPs引发的种子中CDPK和钙调蛋白相关钙传感器蛋白的上调在AgNPs引发的水稻种子中很明显（图5A）。上述结果表明，ROS可以与其他信号转导途径（如CDPK，MAPK和激素）相互作用，以响应AgNPs增强的ROS。
细胞信号传导导致转录因子（TF）的调节，从而进一步调节靶基因的表达。因此，TFs作为信号传导的终点和基因调控的起点，在植物对生物和非生物胁迫的响应中起着重要作用。AgNPs引发的种子显示出几种TF的增强表达（图5B）。因此，这些防御相关TF的改变可能有助于增强水稻种子的耐盐性。
对于参与AgNPs引发的水稻种子防御反应的基因。AgNPs上调了热休克蛋白（HSP）的基因表达（图5C）。植物HSP作为分子伴侣，在保护其他蛋白质免受应激诱导的损伤（如展开和聚集）方面发挥着重要作用。综上所述，水稻种子中这些防御相关基因的上调可能表明AgNPs引发水稻种子的防御反应。
图6总结了AgNPs引发促进水稻种子萌发和增强抗逆性的可能分子机制。在AgNPs启动过程中，AgNPs首先促进了ROS的上调，随后触发了信号通路的上调并激活了防御基因。
图4 | 由AgNPs启动诱导的水稻种子中上调DEG（差异表达基因）的富集KEGG途径
图5 | 用AgNPs引发的水稻种子中差异表达基因的热图
a) 激素信号转导相关基因;
b) 转录因子（TF）基因;
TF靶向负责防御和加速种子萌发的基因;
图6 | AgNPs引发增强水稻种子萌发和抗逆作用机理示意图
6. “压力记忆”的持续时间
AgNPs触发胁迫/免疫反应增强了水稻种子的胁迫耐受性。对AgNPs启动诱导的“压力记忆”的持续时间值得探究。因此，通过实验表明AgNPs引发的水稻种子在非胁迫条件下生长4周，然后暴露于盐3天。研究发现，AgNPs引发显著缓解了盐诱导的水稻幼苗生长抑制（图7A，B）。这些结果表明，AgNPs启动触发的“压力记忆”可以持续数周。AgNPs引发显著使叶片MDA含量降低（图7C）。此外，水稻叶子的总抗氧化能力增加（图7D）。这些数据表明，即使在种子灌注一个月后，水稻幼苗的一般氧化还原能力也有所增加。
图7 | AgNPs种子启动对水稻幼苗耐盐性能
7. AgNPs-启动增强水稻抗瘟病性能
在植物中，ROS在非生物和生物胁迫传感中都起着至关重要的作用。继续用实验测试AgNPs启动是否可以抑制水稻病原体。将4周龄水稻幼苗的分离水稻叶滴接种米粒分生孢子菌分生孢子悬浮液。接种后7天，所有测试的叶片中都出现疾病症状（棕色病病变）（图8A）。然而，用AgNPs预处理的水稻幼苗的病变大小远小于对照叶片（图8B）。这些结果表明，AgNPs引发对稻瘟病的侵染有中度抑制作用，但不能完全抑制稻瘟病侵染。因此，推测水稻叶片的抗病能力来自启动触发的应激/免疫反应（“应激记忆”），而不是AgNPs本身的抗菌活性。
图8 | 分离叶测定 （DLA） 的结果
a) 代表性图像显示，与对照（加氢灌注）相比，AgNPs种子灌注后叶瘟病敏感性降低;
b) 稻瘟疫感染稻叶的病变大小;
相关讨论
这项研究表明，用ROS增强AgNPs预处理的水稻种子不仅可以在盐条件下更快，更好地种子发芽，还可以保护幼苗免受未来的非生物（盐）和生物胁迫（稻瘟病真菌）的影响。
组学的应用能够阐明增强抗性的分子机制。信号和防御相关代谢物和基因的上调表明种子启动触发应激/免疫反应，从而能够对未来的应激做出快速而强烈的防御反应。纳米生物刺激剂就像植物“疫苗”。获得的“免疫力”已经持续数周，但这种影响是否会持续数月，甚至持续到下一代，仍然未知。
此外，由于触发的全身抗性，这种“疫苗”可能会赋予水稻幼苗免受广谱病原体和多种非生物胁迫（例如干旱、热、冷、倒伏）的保护。此外，在其他生长阶段，种子灌注与全株灌漆（叶面喷洒或根部灌溉）相结合可能会增强保护作用，这也值得在未来的研究中尝试。这是一种设计气候适应型工厂的简单而有效的策略，可以为气候变化引起的粮食不安全问题提供可持续的解决方案。
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本研究采用多组学（代谢组学和转录组学）技术，表征了AgNPs引发的水稻种子的转录变化和水稻种子的代谢变化，提示AgNPs启动触发水稻种子中的代谢和转录重编程，通过多组学分析技术挖掘潜在机制通路。为文章增添风采，值得借鉴。
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