中国药科大学 生物药物分析 我也不记得第几章 多糖类药物分析

1、   来源分类：动物、植物、微生物、海洋生物。

2、   组成分类：均一多糖、不均一多糖、粘多糖：含氮的不均一多糖；结合糖：肽聚糖、脂多糖、糖蛋白和蛋白聚糖。

3、   多糖的理化性质：旋光性、硫酸蒽酮反应：（620nm），硫酸苯酚反应（490nm），氨基己糖－乙酰丙酮（525nm），糖醛酸－硫酸咔唑（520nm）。

4、   多糖纯度测定：（1）超离心法：单一区带；（2）电泳法：单一色带；（3）凝胶色谱法：单一洗脱峰；（4）旋光法：均一组分。

5、   多糖分子量测定：凝胶色谱法；粘度法；超离心法、HPLC。

6、   凝胶层析法：将分子量不同的蛋白质通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积大差异，使不同分子量的组分得以分离，最先淋出的是最大的分子。

7、   凝胶色谱法：sephadexG-200，多糖标准品，分部收集，硫酸苯酚检测，分别求得洗脱体积Ve，Ve与1gM之间存在着线性关系，绘制标准曲线。将待测样品上柱，待测多糖Ve，通过标准曲线求出待测多糖分子量。

8、   粘度法：用已知结构的相似的多糖决定K值，然后测出待测多糖的特性粘数n,计算待测多糖的分子量。

9、   超离心法：根据测得的沉降系数计算多糖的平均分子量。

10、             HPLC测定分子量及分布：色谱条件：凝胶柱，示差折光检测器。

11、             多糖含量测定：比色法（硫酸咔唑法、乙酰丙酮法、硫酸苯酚法、蒽酮法）；生物测定法（肝素钠）；生色底物法（低分子量肝素钠）

12、             乙酰丙酮法——氨基己糖；原理氨基己糖在碱性条件下加热，可与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，该衍生物与对一二甲氨基苯甲醛反应，该反应物呈红色，与525nm测定吸收度。

13、             硫酸咔唑法测糖含量：在浓硫酸中，己糖醛酸与咔唑溶液反应生成的反应物呈红色，520nm。

14、             硫酸苯酚法：多糖在浓硫酸作用下水解成单糖，该单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，在490nm处有最大吸收，其吸光度与浓度呈线性关系。

15、             硫酸蒽酮法测定糖含量（总糖）：原理：多糖在浓硫酸中水解后，进一步脱水生成糠醛类衍生物，与蒽酮作用形成蓝色化合物，620nm处进行比色测定。

16、             肝素测定：美国药典采用羊血浆法。既比较肝素标准品和供试品延长血浆凝结时间的作用来测定肝素的效价。

17、             肝素、低分子量肝素生色底物法原理测定。当蛋白酶（FXA）从生色底物分裂出pNA时，发色物的产生量与剩余的酶量成正比，与肝素效价成反比，405nm测定。

18、             多糖类药物的结构分析：单糖组成、糖苷键连接方式、糖苷键连接位置

19、             多糖组成单糖的分析：（1）水解方法；完全酸水解法，部分酸水解、碱水解、乙酰解、甲醇解、酶降解（2）鉴定。

20、             完全酸水解法：水解难易取决单糖性质及构型。己聚糖一般用1mol/L硫酸，70℃，8h。氨基葡聚糖为4mol/L盐酸，100℃，9h。

21、             部分酸水解、碱水解法：选择温和的条件水解多糖，使糖链中某种类型的碱特异性地打断。（3）乙酰解：多糖经过乙酰解反应（醋酐、冰醋酸），可生成乙酰化单糖和寡糖。

22、             甲醇解：多糖链在80－100℃条件下与无水甲醇反应能将糖链变成组成单糖的甲基糖苷。甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，进行气相色谱分析。

23、             酶降解：分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。外切糖苷酶：切下多糖非还原末端的一个单糖，并对单糖组成和糖苷键，释放多糖链片段以利于结构分析。

24、             单糖的分离鉴定：气相色谱法，hplc，气质联用。

25、             气相色谱法常用的衍生物有：三甲硅烷（TMS）衍生物、三氟乙酰（TEA）衍生物、乙酰（AC）衍生物，甲基衍生物。糖苷键连接方式的测定：（1）红外光谱，确定吡喃糖糖苷键时，890cm-1处有特征吸收为β－糖苷键，840cm-1处为a－糖苷键。（2）核磁共振谱：化学位移5.4、5.1为a型糖苷键，4.53为β型糖苷键。

26、             糖苷键连接位置的确定：（1）高碘酸氧化，Smith降解、（2）甲基化反应产物分析、（3）乙酰解后质谱分析。

27、             高碘酸氧化：原理：选择性的氧化降解反应，能够作用于多糖分子中1，2－二羟基和1，2，3－三羟基，生成过碘酸氧化产物；此产物用硼氢化钠还原后，再用酸水解，生成相应的醛、甲酸，室温下用稀无机酸水解还原产物。1，2连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原得到稳定的多羟基化合物，再用稀盐酸水解，得到甘油及甘油醛。1，3连接的糖苷键与高碘酸不起反应，经还原与水解后得到原来的单糖。1，4连接的糖苷键经高碘酸氧化后的产物用硼氢化钠还原，用稀盐酸水解得到最终产物为赤藓醇和乙醇醛。1，6连接的糖苷键：得到甘油及乙醇醛。

28、             甲基化反应产物分析：多糖经甲基化作用使分子中的羟基甲基化，然后用甲酸和三氟醋酸水解，以气相色谱鉴定甲基化水解产物。

29、             乙酰化后质谱分析：多糖经过乙酰化反应（醋酐、冰醋酸）生成乙酰化单糖和寡糖。用氯仿抽提，蒸去氯仿，进行质谱分析。分子离子峰如有二乙酰葡萄糖或二乙酰单糖碎片峰，表明有支链结构。