生物大分子的分离纯化之冰冻干燥

 冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。

  冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明：

  图中OA是固液曲线，OB是汽液曲线，OC是固汽曲线，O是三相点。当温度在三相点O以下，将压力降至OC线以下，溶剂（通常是水）就可以由固相直接升华为汽相。例如，冰在－40℃时其上方的蒸汽压为0.1毫米汞柱mmHg，在－60℃时其上方的蒸汽压为0.01毫米汞柱mmHg。固态的冰升华为水蒸汽时要吸收大量的热，1克0℃的冰变成0℃的蒸汽需吸热580千卡，所以升华时又可以使固态的冰进一步降温，空气潮湿时可以看见装有固态冰的容器外壁上结有霜。

  冰冻干燥得到的生物大分子固体样品有突出的优点：①由于是由冰冻状态直接升华为汽态，所以样品不起泡，不暴沸。②得到的干粉样品不粘壁，易取出。③冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。

  冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。对于极个别的在冻干时易变性失活的生物大分子则要十分谨慎，务必先做小量试验证明冻干无害后方可进行大量处理。

  冰冻干燥机的国产品牌近年来发展很快。如北京的军事医学科学院生产的小型、中型和大型工业用冰干机，已可以取代昂贵的进口产品。在实验室中还可以自已组装小型简易的冰冻干燥器。①准备一个较大的玻璃真空干燥器，将样品置于小培养皿中速冻后放入干燥器内，器内已事先用两个小培养皿分别盛有KOH(或NaOH) 和 P2O5，干燥器通过一个两端塞上棉花其中装满P2O5的干燥管与真空泵相连，抽真空后，经过5～10小时就可以得到冰冻干燥的样品。②将样品溶液置于一个园底烧并内，将烧并浸入干冰～乙醇低温浴（－60℃）中，样品即被速冻成冰块，将烧并标准磨口通过磨口管与一个冷阱相连，冷阱内放有干冰～乙醇混合液，冷阱的另一个出口管与真空泵相连，抽真空时汽化的水汽就冻结在冷阱的内壁上，抽真空数小时后即可在烧并中得到冻干的样品。此简易装置也可用于冻干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有机溶剂的样品，可重复以下的操作除去这些有机溶剂：样品速冻→→抽真空至恒定→→使样品升温至室温挥发有机溶剂→→再速冻样品，如此反复多次，以除尽有机溶剂，否则样品不易冻干，且泵前应装有保护真空泵的缓冲并，以吸收水份和有机溶剂。

  冰冻干燥操作虽然十分简单，但以下的注意事项却必须认真记取：

  ⑴样品溶液：①样品要溶于水，不含有机溶剂，否则会造成冰点降低，冰冻的样品容易融化，因而减压时会起大量泡沫，使样品变性、污染和损失。同时若含有有机溶剂，被抽入真空泵后溶于真空泵油，使其可达真空度降低而必须换油。②样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否则冰冻后易融化，影响样品活性，而且不易冻干。③样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化，例如pH 7.0的磷酸盐缓冲液在冰冻时，磷酸氢二钠比磷酸二氢钠先冻结，因而使溶液pH下降而接近3.5，使某些对低pH敏感的酶变性失活，此时需加入pH稳定剂，如糖类和钙离子等。④样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。同批冻干的样品液浓度不宜相差太大，以免冻干的时间相差过大。

  ⑵装样品溶液的容器：①最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长，耗电太多。也可以使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超过2 cm，否则烧杯易冻裂。②冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。

  ⑶溶液冰冻：如有条件，尽可能用干冰～乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层，则可以大大加快冻干的速度。

  ⑷冻干：①样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。②样品冻干达到较高真空度时，容器外部有时会结霜，若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可。③冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。④仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。⑤样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。⑥真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油，通常半年或一季度至少要换一次油。