7种细胞死亡全整合，基于RCD进行肿瘤分型+多组学分析+预后模型+实验验证，一把拿下8分

2023年了，还是想在细胞死亡方向深耕一下，看看有没有潜在的细胞死亡新热点、新思路能发高质量生信文章？

一般有三条路：一个是刚爆出来的热点抢发纯生信，比如前两天提出的“双硫死亡”和去年爆火的“铜死亡”，这条路要想发高分就是需要眼疾手快赶上热点红利期

另一条路就是在思路上创新，热点串联可以做“多个细胞死亡形式的整合分析”或者“细胞死亡联合其他热点（m6A、氧化应激、线粒体等）分析”··· 还可以在分析内容上增加些亮点，比如多组学分析（转录组+基因组+表观组）···

最后一条路就是加验证实验，走干湿结合的路子，这也是生信发展的大趋势，并且这个趋势已经到来了~ ~

小云这次分享一篇8分+ 细胞死亡方向思路创新+验证实验，两条路联合的文章——基于7种调节性细胞死亡（RCD）进行肿瘤分型分析+多组学分析+预后模型构建+实验验证，干湿结合大趋势下妥妥的8分+质量！附带7种RCD基因集合，换个疾病就能复现啦，心动不如行动哦

l 题目：关于非小细胞肺癌预后和免疫景观的特异性调节细胞死亡相关分型

l 杂志：Front. Immunol.

l 影响因子：IF=8.786

l 发表时间：2023年2月

数据来源

研究流程

基于TCGA数据库中3429个RCD相关基因进行一致性聚类，确定了5个非小细胞肺癌亚组，并描述了这些亚组的基因组特征、免疫景观和免疫治疗/化疗反应的特征。筛选正常和肿瘤样品之间的差异RCD相关基因，单变量cox回归分析筛选与OS显著相关的基因，Lasso回归和多变量Cox回归构建基于53个RCD相关基因的预后模型，并进行模型评估和验证。分析RCD风险模型对免疫疗法和化疗反应的预测作用，分析关键基因LDLRAD3表达与预后的相关性，并在细胞样本中验证其功能。

主要结果

1. 基于RCD相关基因的非小细胞肺癌分型分析

使用RCD相关基因的表达矩阵进行无监督聚类分析（ps：私信小云获得基因集合哦），获得了五种不同的NSCLC亚型（图1A）。KM生存曲线分析5种亚型间的预后差异（OS、DFI、PFI）（图1D-F）。GSVA分析5种亚型之间细胞死亡相关途径的富集分数差异（图1I）。（ps：KM生存曲线绘制、GSVA分析也可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据一键出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。 

图1 基于RCD的分型分析

2. 不同聚类中肿瘤微环境与化疗反应分析

在TME中，三级淋巴结构(TLS)被认为是免疫细胞的生发中心，所以首先评估了5个亚型中一系列参与TLS形成的趋化因子的表达差异（图2A）。然后通过xCELL算法分析5个亚型中免疫细胞和基质细胞的比例（图2B），并进一步计算了5个亚型中的免疫得分、基质得分、估计得分（图2D）和免疫检查点基因的表达（图2F）。由于化疗是非小细胞肺癌治疗的基础，所以最后评估了每个亚型对化疗的反应（图2H）。（ps：在TME相关分析中分析TLS的比较少，比较新颖，分析又比较简单，这一点可以学起来哦！另外，TLS也可以单独作为一个方向来做生信分析，小云之前也分享过TLS生信思路，感兴趣的小伙伴可以公众号搜索观看）

3. 不同亚型间的富集途径、体细胞突变和DNA甲基化模式多组学分析

通过GSVA分析研究了5个亚型中的富集途径（图3A）。通过R package MAF tools评估了5个亚型中RCD相关基因的体细胞突变（图3B）和拷贝数变异（图3C），通过R package ChAMP评估了RCD相关基因的差异甲基化位点（图3E）。

图3 多组学分析

4. RCD风险模型的建立与验证

筛选正常和肿瘤样品之间的差异RCD相关基因，单变量cox回归分析筛选与OS显著相关的基因，通过LASSO/Cox回归建立基于53个RCD基因的风险模型（图4A）。根据风险评分中位数分为高风险组和低风险组，进行KM生存分析并利用ROC曲线评估模型的敏感性和特异性（图4C, D），在GEO验证集中进行模型验证（图4E, F）。利用Cox回归模型评估RCD风险评分的独立预后价值（图4J）。（ps：单因素/多因素Cox回归、LASSO回归分析都可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现哦，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。 

图4 RCD风险模型的建立与验证

5. RCD风险模型对免疫疗法反应预测

首先利用KM曲线评估接受抗PD-1/PD-L1治疗的高和低RCD风险组NSCLC患者的PFS预后（图5A，B）。随后分析了IMvigor210队列中风险评分与免疫治疗反应的相关性（图5C, D），进一步使用肿瘤免疫功能障碍和排除(TIDE)评分来验证RCD-风险模型在预测免疫反应的优越性（图5E）。通过xCELL算法分析高和低RCD风险组中免疫细胞和基质细胞的比例（图5F），并进一步比较了两组间免疫检查点基因的表达（图5G）和TLS趋化因子的表达（图5K）。

6. 关键RCD预后基因的筛选和验证

为了验证RCD-Risk模型的临床可应用性，进一步分析了模型中的RCD基因，发现LDLRAD3 mRNA在癌症中的作用鲜有报道，所以后续将探索LDLRAD3的功能。首先KM生存曲线评估高或低LDLRAD3表达的NSCLC患者OS预后（图6A），单变量和多变量Cox分析确定了LDLRAD3的独立预后价值（图6B, C）。利用NSCLC标本的组织微阵列(RLN121e)验证LDLRAD3的表达，以及与预后的关系（图6D, E）。随后在NSCLC细胞中将LDLRAD3过表达，通过CCK8、克隆形成、transwell实验评估LDLRAD3对肿瘤增殖、迁移和侵袭能力的影响（图7）。

文章小结

这篇文章的分析内容比较丰富，数据量较大，先进行肿瘤分型和多组学分析，再构建风险模型，最后再加上关键基因的表达和功能验证，干湿结合打造出了1篇名副其实的8分+文章。目前这种将多种细胞死亡整合分析的生信文章还不多，也就是说让你去发挥的空间相当大哟，利用这篇文章搜集到的基因集合，换个癌种能复现，快行动起来吧！