酵母菌的形态观察和大小测定

       酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。

       美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。

       微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物细胞个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具—测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和目镜测微尺。先用绝对长度的镜台测微尺来校正不表示绝对长度的目镜测微尺，计算后者每格所代表的实际长度，然后放上待测的标本，用目镜测微尺测定标本上微生物细胞占目镜测微尺的格数，就可计算该微生物的大小。酵母菌的直径约8-10μm。

       镜台测微尺是一张中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定目镜测微尺每小格的相对长度。通常，刻度的总长是1mm，被等分为100格，每格0.01mm（即10μm）。镜台测微尺不直接用来测量细胞的大小。

       目镜测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格的两种。在测量时将接目测微尺放在目镜的隔板上，即可来测量经显微镜放大后的细胞物象。也有专用的目镜，里面已经安放好了目镜测微尺。

       由于目镜测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合下放大倍数不同，目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用目镜测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。

菌种:

试剂:

器材:

实验方法:

1 .测微尺的构造和使用方法

(1) 目镜测微尺的构造

目镜测微尺是一块圆形玻片，其中央刻有精确的刻度，通常是将5mm划分为50格，实际每格等于100μm。刻度的大小是随使用的目镜和物镜的放大倍数而改变，用前必须用镜台测微尺来标定。

(2) 镜台测微尺的构造

镜台测微尺为一块特制的载玻片，其中央有一小圆圈。圆圈内刻有分度，将长1mm的直线等分为100小格，每小格等于10μm。2. 目镜测微尺的标定

(1)取下目镜，旋下目镜上的目透镜，将目镜测微尺放人接目镜的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透镜，并装入镜简内;

(2)将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，同观察标本一样，使具有刻度的小圆圈位于视野中央 ；

(3)先用低倍镜观察，对准焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行，并使两尺的左边第一条线相重合，再向右寻找两尺的另外一条重合线；

(4) 记录二条重合线间的目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。

3. 酵母菌大小的测定

       目镜测微尺标定完毕后，取下镜台测微尺，换上微生物标本片，将其固定在载物台上，先用低倍镜找到标本片图象，然后根据不同的微生物对象分别转换到高倍镜下，用目镜测微尺测量微生物细胞的直径或宽和长所占的格数，再依据所标定的高倍镜每一格的实际长度计算细胞的实际大小。

      通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小，为了尽量减小实验误差，应在同一标本片上测量10~20个细胞，取其平均值作为该菌的大小。

4. 实验完毕后的处理

       测量完毕，换上原有显微镜目镜（或取出接目测微尺，目镜放回镜筒），用擦镜纸将测微尺擦拭干净后放回盒内保存，并按照显微镜的使用和维护方法擦拭物镜。

10倍镜下目镜测微尺的标定

(1)镜台测微尺→置于显微镜的载物台上→同观察标本一样→动横、纵移动手柄→具有刻度的小圆圈位于视野中央。

(2)转动物镜转换器到10倍镜镜头→转动粗准焦螺旋→转动细准焦螺旋→将光圈调到（10×） →调到看清镜台测微尺的刻度。

(3)转动目镜→使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行→使两尺的左边第一条线相重合→再向右寻找两尺的第二条重合线。

(4)计算：目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间镜台测微尺格数×10μm／两个重叠刻度间目镜测微尺格数

40倍镜下目镜测微尺的标定

(1)转动物镜转换器到40倍镜镜头→转动细准焦螺旋→将光圈调到（40×）附近→调到看清镜台测微尺的刻度。

(2)转动目镜→使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行→使两尺的左边第一条线相重合→再向右寻找两尺的第二条重合线

(4)计算：目镜测微尺每格长度=两个重叠刻度间物镜测微尺格数×10μm／两个重叠刻度间目镜测微尺格数

5.酵母菌形态观察

⑴ 菌种：酵母菌

⑵在载玻片中央加一滴吕氏碱性美蓝染色液，用接种环取酵母菌菌苔少许与美蓝液混合均匀；

⑶用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上； 将制片放置约3min，先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。

（2)混合和固定酵母菌

(3)开始镜检

打开显微镜先低倍镜后高倍镜观察酵母形态和出芽情况，并根据颜色区别死活细胞。

6、酵母菌大小的测定

取下镜台测微尺，换上微生物标本片，测量微生物细胞的直径或宽和长所占的格数。

注意事项:

1．加染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。

 2．盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。