USP7是人类细胞中PCNA泛素化和氧化应激诱导突变的抑制因子

写在前面

        今天推荐的是由名古屋大学环境医学研究所团队在2015年12月15日发表于Cell Reports（IF：7.985，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Chikahide Masutani教授，研究表明USP7可以独立于细胞周期抑制氧化应激诱导的PCNA泛素化和突变。

研究背景

        PCNA（增殖的细胞核抗原）翻译后的单泛素化是调控DNA跨损伤复制（TLS）通路的重要事件。单泛素化的PCNA可激活具有致突变性的DNA聚合酶，因此严格调控PCNA的单泛素化水平是避免不必要突变的关键。在人类细胞中，E2-泛素结合酶RAD6和E3泛素连接酶RAD18在PCNA的泛素化中起着重要作用。

        去泛素化酶（DUB）对于调节细胞中蛋白的泛素化水平有着关键作用。USP1的下调提高了PCNA的单泛素化水平，这是DNA复制时受到UV照射后产生的。相比之下，氧化应激诱导的PCNA单泛素化不受USP1调控。此外，最近的许多报告表明，USP7在DNA损伤应答中起作用。USP7通过调控染色质结构参与氧化DNA损伤的修复。USP7还与PCNA泛素化系统的调控有关。研究表明，USP7通过调节Polƞ的稳定性间接调控UV诱导的PCNA单泛素化。

摘要部分

        在这项研究中，作者使用体外检测系统鉴定了USP7为单泛素化PCNA的去泛素化酶。研究发现，USP7和USP1的下调以不同的方式提高了UV照射和氧化应激诱导的PCNA单泛素化水平。重要的是，USP1和USP7的下调分别促进了UV诱导和H2O2诱导的DNA突变，而RAD18的下调则消除了这两种作用。这些结果表明，USP7通过将单泛素化的PCNA去泛素化来调控人类细胞中DNA损伤诱导的突变。

研究内容

1.USP7在体外介导单泛素化的PCNA去泛素化

        为阐明PCNA单泛素化的调控机制，作者研究了HeLa细胞提取物中可在体外调控泛素化的蛋白质因子。最终，作者确定了一个140 kDa的调控泛素化的蛋白。质谱（MS）分析显示该多肽为泛素特异性蛋白酶USP7，USP7可以介导单泛素化的PCNA去泛素化。另外，没有其他蛋白质与USP7被共同纯化出来。因此，作者认为USP7在体外介导单泛素化的PCNA去泛素化是其固有功能，不需要辅助因子。

研究结论：USP7可独立行使其去泛素化功能，它可以去除单泛素化PCNA上的泛素分子。

2.USP7可显著抑制UV或H2O2诱导的PCNA单泛素化

        实验发现，对USP1的抑制提高了UV诱导或未辐射细胞中PCNA的单泛素化水平。在USP7被抑制的细胞中PCNA的单泛素化水平也明显高于对照细胞，但不如USP1被抑制的效果明显。研究表明，在UV照射早期和未照射状态下，USP1在抑制PCNA单泛素化的过程中起着重要作用，并且USP7也发挥一定的定量调控作用。此外，即使没有USP1和USP7，UV诱导的PCNA单泛素化也在24h下降，这表明细胞具有清除单泛素化PCNA的其他机制。     

        H2O2处理后，PCNA的单泛素化水平立即增加，15-30min后达到最大值，2h内几乎消失。H2O2以剂量依赖的方式促进PCNA的单泛素化。值得注意的是，对USP7的抑制比抑制USP1在更大程度上促进了H2O2诱导的PCNA单泛素化。此外，在WI38VA13、HeLa等多种细胞系中抑制USP7均提升了H2O2诱导的PCNA单泛素化水平。

        在表达K164R突变的PCNA-HA细胞中，作者未观察到USP7被抑制后H2O2诱导的单泛素化增加。此外，共同抑制RAD18与PCNA后，抑制USP7对于促进PCNA单泛素化的效果显著降低。这些结果表明，USP7调控H2O2诱导的PCNA单泛素化是以RAD18依赖的方式在164位赖氨酸上发生的。

研究结论：USP1和USP7均有助于抑制UV诱导的PCNA单泛素化，其中USP1起主要作用。而USP7还具有抑制H2O2诱导的PCNA单泛素化的功能。   

3.USP7具有独立于细胞周期的抑制PCNA单泛素化的功能

        接下来作者研究了USP7在不同细胞周期对PCNA泛素化的调控。实验显示，对USP7或USP1的抑制并没有改变释放后的同步效率和细胞周期进程。另外，无论UV或H2O2处理，对照组和USP7抑制的细胞在释放后8h的USP1蛋白水平均低于16或20h，这与先前报道的USP1在G0/G1期下调一致。另一方面，在对照组或USP1被抑制的细胞中，USP7蛋白水平在整个细胞周期中都没有变化。     

        对USP1的抑制在进入细胞周期后的16和20 h促进了UV诱导的PCNA单泛素化，但在8 h则没有。这表明USP1抑制了UV诱导的DNA复制中的PCNA单泛素化。此外，进入细胞周期后的8、16或20 h，USP7对UV诱导的PCNA单泛素化没有作用。

        进一步研究表明，对USP1的抑制在进入细胞周期后的16和20 h比8 h在更大程度上提升了H2O2诱导的PCNA单泛素化水平。与之相反，对USP7的抑制在三个时间点均促进了H2O2诱导的PCNA单泛素化。

研究结论：USP1对于抑制复制偶联中的PCNA单泛素化至关重要，而USP7可独立于细胞周期事件抑制PCNA的单泛素化。

4.USP1和USP7在抑制UV和H2O2诱导的突变中有独特作用     

        实验显示，抑制USP1基本不影响细胞对UV的敏感性。另一方面，USP7通过稳定UVSSA促进了UV诱导的DNA损伤的修复，且USP7与UVSSA的敲低也提高了细胞对UV的敏感性。此外，USP7和/或USP1的抑制不影响细胞对H2O2处理的敏感性。     

        在supF突变分析中，对USP1的抑制促进了UV诱导的突变。与此相一致，UV照射后，USP1被抑制的细胞中的突变频率增加，而共抑制RAD18抑制了这种增加。这些表明该突变是以PCNA泛素化的方式诱导的。对USP7的抑制也可能增加UV诱导的突变，但并不明显。

        相比之下，两个独立的siRNA对USP7的敲低显著提高了H2O2诱导的HPRT突变率。而RAD18的共抑制降低了突变频率的增加，表明该突变也是以PCNA泛素化的方式诱导的。无论USP7处于何种状态，抑制USP1都不会增加H2O2诱导的突变频率，这证实了其在H2O2诱导的突变中的次要作用。

 研究结论：USP1可以通过控制PCNA泛素化来抑制UV诱导的突变。另一方面，USP7以独立于USP1的方式来调控PCNA泛素化，从而在不依赖细胞周期的过程中抑制H2O2诱导的突变。

结论与讨论

        作者发现USP1和USP7分别显著抑制了UV和H2O2诱导的PCNA单泛素化和DNA突变，这表明细胞可以根据DNA损伤的类型和细胞周期选择合适的DUB机制。此外，即使在USP1和USP7均被抑制的细胞中，H2O2和UV诱导的PCNA单泛素化最终也消失了，这表明细胞还有其他机制来清除泛素化的PCNA。因此，未来的研究应解决多个DUBs在DNA损伤耐受下是如何协同调控的。

Thank you!

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2015.11.014