项目文章丨人类半月板变性中局部微环境的细胞特征:单细胞转录组学研究
四川大学华西医院骨科运动医学中心付维力副教授与清华大学张学工教授团队合作在国际著名生物学综合期刊 eLife 发表题为“Cellular features of localized microenvironments in human meniscal degeneration: a single-cell transcriptomic study”的研究论文，利用单细胞测序结合多重免疫荧光的方法，构建了健康状态以及退变状态下半月板红、白区细胞图谱，为研究半月板内微环境稳态以及探索骨关节炎的发生机制提供重要依据。该研究中的单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。
【发表期刊】eLife
【影响因子】8.713
【发表单位】四川大学华西医院，清华大学
研究背景
半月板是膝关节的重要组成部分，在膝关节软骨的承重、减震、营养和润滑等方面发挥着重要作用，但其非常容易受伤，修复潜力有限。半月板退变是骨关节炎（OA）和关节功能障碍的重要危险因素之一，充分了解退行性半月板的变化对于预防中青年患者半月板损伤和缓解老年膝关节骨性关节炎患者的症状至关重要。
研究思路
研究结果
1、利用单细胞 RNA 测序解析人类半月板的主要细胞类型
文章首先展示了作者从 8 名患者的共计 12 个（6 个正常vs 6 个退行性）半月板样本中得到 45,744 个单细胞数据，来解析人类半月板的细胞异质性。在半月板内侧白区中鉴定得到 5 种主要的细胞类型：软骨细胞、淋巴细胞、髓样细胞、内皮细胞和 ACTA2+细胞（图1D）。在半月板外侧红区中鉴定得到 6 种细胞类型，除软骨细胞、淋巴细胞、髓样细胞、内皮细胞及 ACTA2+ 细胞外，还有 Schwann 细胞（图1G），表明半月板红区中存在神经组织。此外，在半月板红区细胞中，与正常组相比，退化组的免疫细胞比例较高，而 ACTA2+ 细胞比例较低（图1H）。
2、进一步聚类揭示软骨细胞与周细胞（PCL）的异质性
接下来文章通过单细胞测序结果，进一步对软骨细胞及 PCL 细胞聚类，建立分级式细胞类型分类框架（图2）。最终软骨细胞鉴定得到 5 种细胞亚型，分别为 Ch.1-Ch.5，PCL 细胞聚类得到 PCL.1、PCL.2 两种细胞亚型。每个亚型都具有特定的基因调控模块（图2D），例如，软骨细胞亚型 Ch.1 具有抗血管生成的功能，Ch.3 亚型中高水平表达的 PRG4 基因与关节软骨表面润滑功能相关，可能具有润滑功能。表明了软骨细胞及 PCL 细胞内部的异质性。
3、通过差异基因表达与富集分析揭示软骨细胞及 PCL 细胞相关功能变化
与正常组相比，Ch.1、PCL 细胞占比下降，Ch.2、Ch.3、Ch.4 亚型占比增加（图3B）。其中，Ch.2 亚型中 OA 标记基因和软骨细胞肥大基因高表达（如胶原基因（COL1A1/2，COL3A1，COL6A1/2/3），POSTN，MMP2，SPARC，MXRA5等），表明 Ch.2 与异常细胞外基质（ECM）退化和重塑相关（图3A）。Ch.4中补体替代激活途径（C1R，C1S，C2，C3，C6 和 C7）相关基因高度表达，可能通过富集巨噬细胞和中性粒细胞来促进炎症（图3）。在 PCL 细胞中发现有多种潜在的血管生成抑制基因的表达，促血管生成基因表达较低。PCL.1 和 PCL.2 中均发现了与抗血管生成功能相关的 COL4A1、COL4A2 和 COL18A1 等基因表达。PCL.1 对促炎细胞因子 IL-1 和 TNF-α 有更积极的反应（图2G），PCL.2 具有较高的肌原纤维基因表达，肌肉收缩力较高，可调节微血管中的血液流动。此外，退变组半月板外侧的炎症评分始终显著高于正常组，推断半月板外侧区域的退变可能对关节炎症影响更大。
4、利用细胞间通讯分析解析半月板退变机制
在正常和退化半月板样本中对白细胞进一步聚类，鉴定得到巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞、T 细胞和循环免疫细胞（图4A，B）。根据配体-受体的表达推断细胞-细胞相互作用（CCIs），与正常组相比，退变组 CCI 强度普遍升高，尤其是内皮细胞和免疫细胞（图4I）。CXCL8 基因在退变组的巨噬细胞/单核细胞、中性粒细胞、DC 中上调，其受体基因 SDC2 在软骨细胞和 PCL 细胞中均有表达。退变组血管新生进程中也出现了显著的 CALM1/2-INSR CCIs，多数细胞类型中 CALM1/2 上调，内皮细胞中胰岛素受体基因 INSR 上调，表明胰岛素受体具有促血管生成功能。
结论
免疫细胞和内皮细胞可能是软骨细胞和细胞外基质的重要调节因子（图5）。免疫细胞可以感知 DAMP 信号，在半月板炎症进程中产生细胞因子和趋化因子。同时，炎症可以增强 ECM 分解代谢酶，如 MMP/ADAM/ADAMTS，刺激血管增殖，进一步促进半月板中的免疫浸润效果。这些因素以一种类似“正反馈循环”的方式起作用。正常情况下，当 DAMP 分子被清除时，可逆转由 DAMP 引起的炎症。但如果上述因素在某些扰动条件下处于“正反馈”通路中，它们将相互促进影响半月板微环境稳态。
