生物制药综合实验（重组质粒模块） 实验一 绿色荧光蛋白基因gfp的PCR扩增

实验目的：

1. 掌握绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因的原理

2. 掌握PCR方法扩增基因的原理和方法

实验原理：

    聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， 简称PCR）是于上世纪80年代中期发展起来的一种体外核酸扩增技术，即在模板DNA、引物、脱氧核糖核酸存在的情况下，经过耐热DNA聚合酶的作用，通过模板DNA的变性，DNA与引物的退火及引物的延伸三个步骤，循环反复，使DNA片段在短时间内迅速扩增，几小时内将待扩增基因放大几百万倍，使得肉眼就能直接观察，便于DNA的分析检测，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

    本实验中使用的TransStart FastPfu DNA Polymerase是用于快速PCR扩增的热启动、高保真DNA聚合酶，其扩增能力强、扩增速度快，保真性为常规Taq DNA聚合酶的54倍，其PCR产物为平末端，不同于Taq DNA聚合酶。PCR产物可用于平末端连接

实验材料：

1. 试剂：载体pCAMBIA1302；TransStart FastPfu DNA Polymerase（全式金）；引物（gfpf：5-GGATCCAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCAC-3；gfpr：5-CTCGAGTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3，安徽通用（系统）生物公司合成）；dNTPS（10mM each）；1×TAE电泳缓冲液；Loading buffer；琼脂糖。

2. 实验器具：PCR仪，电泳仪，凝胶成像仪。

实验步骤：

1. 稀释DNA模板pCAMBIA1302（10倍、50倍、100倍）

2. 按照下表配制PCR反应Mixture，每个反应体系25μl。

3. PCR扩增gfp基因，反应程序见下表：

4. 电泳及凝胶成像仪检测。