2023.7.11华中农业大学全英文选修课程生物技术中的微生物学课程第二节课程要点

注：可能存在不准确情况，配套本人已投稿视频进行观看 

对于组成细胞的主要分子类型，包括蛋白质、碳水化合物、脂质、核酸等进行了介绍。介绍了PCR（聚合酶链式反应）技术中如何检验PCR反应是否成功，通过做琼脂糖凝胶电泳来检测DNA是否存在。介绍了琼脂糖凝胶电泳的制备方法，以及通过观察琼脂糖凝胶电泳的孔洞得出DNA是否存在的结论。讲解了组成蛋白质的氨基酸中有些带正电荷，有些带负电荷，蛋白质本身也可以带有正电荷或负电荷，这对于后续蛋白质分析方法的选择有所帮助。

介绍了不同的分析方法，包括电泳、光谱法、质谱法等，这些方法都是依据分子的性质和特点来进行分析的。讲述了如何进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（Agarose Gel Electrophoresis）实验，以检测PCR反应产物的大小。首先，在凝胶的顶部分成称为“lanes”的小槽，将待检测的DNA样品放入其中。然后，通过给凝胶加电，使DNA样品在凝胶中移动，根据DNA分子大小的不同，会在凝胶上出现不同的分离带。为了可视化这些分离带，需要加入一种荧光染料（如溴化乙锭），并在紫外线下观察凝胶。通过比较DNA分子大小标准品（ladder）和PCR反应产物的大小，可以确定PCR反应是否成功，以及反应产物的大小。此外，为了确保实验结果的准确性，还需要进行一些控制实验，例如检测DNA模板是否完好等。关于PCR实验和Agarose gel的应用。实验中使用两组引物来检测病原体，并运行阳性和阴性对照，以确保实验结果准确。在Agarose gel中，检测到的DNA条带可用于判断样本是否感染了病原体。此外，讨论了plasmid的分析和常用的酶切方法。实验中需要注意控制实验，包括阳性和阴性对照。限制性内切酶是一种重要的酶，可以切割DNA，但仅在特定的序列上切割。这些酶来自细菌。讲了病毒如何通过注入基因组到细胞内制造更多病毒来感染细胞，以及细菌如何进化出限制酶系统来抵御病毒的感染。在生物技术中，我们利用限制酶来构建质粒。此外，还讨论了琼脂糖凝胶电泳的原理和浓度选择，以及荧光原位杂交技术（FISH）的应用。FISH是一种显微镜技术，可以告诉我们核酸的定位。讲解了Fluorescence in situ hybridization (FISH)技术的应用和原理。FISH技术通常用于探究共生体在宿主体内的分布、基因在染色体上的位置以及mRNA的局部化等方面。该技术利用具有荧光标记的探针与目标核酸的互补配对，通过显微镜观察标记的荧光信号来确定目标核酸的位置。FISH技术的主要缺点是需要破坏细胞膜以使探针进入细胞，因此需要牺牲细胞。

主要讨论了分子生物学中的一些概念和技术，包括同义词、原位杂交（fish）、引物（primer）、限制性内切酶（restriction enzyme）、环状DNA（plasmid）、测序（sequencing）等。其中，对原位杂交的解释是指特定引物或探针与样品中的靶DNA序列结合，从而检测出该序列的位置和数量；引物和探针的区别在于前者用于PCR反应，后者则用于原位杂交；限制性内切酶可将DNA切割成特定的片段用于克隆，但若两端的限制性内切酶切口相互匹配，则可能会导致环状DNA的重合；测序可分为Sanger测序和下一代测序，前者适用于对单一模板进行测序，后者适用于对大量模板同时进行测序。Sanger测序的原理是利用缺氧去氧核苷酸（ddNTPs）阻碍DNA链的延伸，从而读取DNA序列。Sanger测序是一种测序DNA的方法，通过PCR反应扩增DNA的片段，然后通过一系列步骤，包括使用特殊的ddNTPs、尺寸排除柱、激光扫描等方式来测序DNA。Sanger测序生成的数据包括一个文本文件和一个色谱图。色谱图中，峰值的高度代表着DNA序列的强度，而出现多个峰值的情况说明该样本是杂合的。Sanger测序技术的优势在于其可靠性和准确性，但其测序长度有限，一般在1000bp以内。

讲述了核酸和蛋白质的研究方法。其中，核酸的研究方法包括琼脂糖凝胶电泳、FISH、Sanger测序和二代测序；蛋白质的研究方法包括SDS-PAGE和Western Blot。在SDS-PAGE中，使用聚丙烯酰胺凝胶和SDS等试剂将蛋白质变性并分离，通过电泳可得到不同大小的蛋白带；而Western Blot是SDS-PAGE的加强版，可以使用特异性抗体检测所需的蛋白质。需要注意的是，SDS-PAGE并不能告诉你具体的蛋白质是什么，需要通过LC-MS/MS等进一步实验确定；而Western Blot可以检测到特定的蛋白质。SDS-PAGE是一种蛋白质分离的方法，可以用来检测不同样品中蛋白质之间的差异。Western blot是一种检测特定蛋白质的方法，适用于已知蛋白质名称并能够找到对应抗体的情况。Western blot的步骤包括：1）进行SDS-PAGE；2）将蛋白质转移到膜上；3）加入一种主抗体，使其识别并结合目标蛋白质；4）加入一种次抗体，使其结合主抗体并产生信号。抗体是免疫系统的一部分，可以识别和结合到病原体表面的蛋白质，从而帮助身体识别和消灭病原体。Western blot的结果通常用抗体名称标记，并且可以确定哪个样品中含有目标蛋白质。在实验设计中需要考虑的因素，例如实验成本、灵敏度、实验周期等。接着，提到了两个检测样本中微生物存在的实验场景，讨论了如何在没有基因组信息的情况下设计PCR引物，以及如何选择PCR扩增的目标基因。研究对象是细菌的核糖体基因，这些基因是高度保守的，如果突变会导致细胞死亡，因此选择这些基因作为研究对象。可以通过多个相关基因组进行比对，找到高度保守的区域，然后设计PCR引物。在检测质粒是否含有插入物时，可以选择使用琼脂糖凝胶电泳的方法，以质粒本身作为阴性对照。

关于实验数据分析及结果判读的讨论。以下：实验数据分析需要多个实验的支持，以提高结果的可信度。在凝胶电泳实验中，通过观察DNA条带的数量和大小，可以判断DNA的形态和大小。如果实验成功，DNA条带应该比阴性对照还要大，出现“上移”的现象。通过测序和限制性酶切分析等多种方法，可以进一步验证实验结果的正确性。多个实验结果一致可以提高结果的可信度，让实验数据更具有说服力。在科研中，要尽可能做多个实验，以确保结果的准确性和可靠性。

确定未知基因的功能是分子生物学研究中常见的问题。有几种实验技术可用于确定未知基因的功能。一种方法是使用基因敲除或基因沉默技术来观察对细胞过程或表型的影响。另一种方法是使用生物信息学，根据未知基因的序列和同源性预测其功能。此外，可以在不同条件下分析基因表达或蛋白质水平，以获得有关其功能的见解。功能测定，如酶测定或蛋白质相互作用测定，也可用于确定基因产物的生化功能。

讨论了如何研究一个基因的功能。Blast算法是用于比对基因序列并推测其功能的一种方法。对于研究基因的功能，可以通过突变基因并观察表型变化的方法来进行反向遗传学研究。对于研究蛋白质的功能，可以通过制备抗体并进行免疫荧光实验来确定其位置，从而推测其功能。表达基因并制备蛋白质是研究蛋白质功能的重要手段。研究一个基因的功能需要进行多个实验，形成一个完整的实验流程，最终推断其功能。还有其他方法可以用于研究基因和蛋白质的功能，例如研究转录本表达等。