【小分子新药研发与原料药CMC】其八 药物化学与工艺化学

合成过程是获取小分子原料药的主要工具，也是小分子新药CMC的首字母（Chemistry）。市售化学品经历一步步反应转化最终得到原料药产品，化学反应贯穿于小分子药物的全生命周期。在药物研发的各个阶段，化学相关的研发内容的研发重点与工作环境都有所区别。

药物化学与工艺化学的知识内核是一样的，都是有机化学。在药物发现阶段，人们需要筛选的候选化合物分子众多（数以万计乃至于百万计的化合物分子被用于筛选）：因此，药物化学的工作重点是高效合成毫克级至克级的化合物库、先导化合物。而在候选化合物的分子结构确定之后，人们在临床前和临床阶段的化学研究重点逐渐从药物化学转向工艺化学：而工艺化学也与相关的制造（Manufacturing）、质量控制（Control），共同组成了小分子新药CMC业务的主体。

本篇文章以药物研发的各阶段为区分标志，介绍小分子新药研发过程中的化学相关工作。

1.     药物发现阶段的化学工作（药物化学）

1.1 苗头化合物（hit）阶段

如本教材第二篇1.2节所述，[1]人们会从一个目标靶点出发，寻找合适的化合物结构，经历一系列筛选与优化，得到候选临床前化合物。用于筛选的化合物大致有两种来源：一种是在过往的药物发现过程中，通过各种方式积累起来的数以万计、十万计、百万计的化合物库；另一种是基于现有的药物设计方案，人们自行设计的、可以被成功合成的化合物库。

我们假设一个拥有成药性质的化合物，它的核心结构由三个关键片段拼接而成；三个片段之中的每一个官能团，都可以有几种、数十种甚至上百种选择。通过排列组合，我们不难理解：对于一个核心结构的化合物，我们可能有数千甚至上万种选择。人们或通过人力、或通过机器辅助的方式，有时借助组合化学的手段，[2]得到成千上万种化合物，建立成化合物库。化合物库中的每一个化合物仅需要毫克级别的量，即能通过高通量筛选等方式，完成与目标靶点分子的亲合力试验，得到一些苗头化合物（hit）。因此，通过人力或者机器辅助的形式建立化合物库，是苗头化合物阶段的药物化学工作。

近年来，人们使用的组合化学的工具日趋多元化，有时候可以高效率地在一轮药物筛选中，筛选数万乃至数十万种化合物。最近，一种叫做“DNA编码化合物库”的组合化学工具成为了行业热点。[3]它利用DNA自身复制拼接的高效性，使用短链DNA分子作为不同片段的载具，在DNA拼接扩增的过程中高效合成各种排列组合的化合物结构；相关化合物结构经历与目标靶点的亲和色谱筛选之后，与目标靶点亲和力强的化学结构会留在色谱上；人们可以通过测定与目标化合物结构直接相关的DNA序列信息，判断相关化合物的结构，即得到苗头化合物的结构信息。

对于大型制药企业与以药物发现为主营业务的CRO企业而言，它们通常经过一段时间的业务积累，拥有很多核心结构片段确定的化合物库。有的时候，一组化合物库对于一个已知的目标靶点可能不产生苗头化合物结构；但是当一个新的目标靶点被学界发现的时候，原来尘封的化合物库可能出现相应的苗头化合物。因此，每一轮新的化合物库的建立过程，对于一个药物化学研发主体而言，都是知识、数据、工具的积累过程。

1.2 先导化合物（lead compound）阶段[4]

人们在获得苗头化合物结构之后，需要经历进一步筛选、结构优化以提高候选药物分子的成药性，这个过程叫做“Hit to lead（H2L）”以及“先导化合物优化（Lead optimization）”。判断一个化合物的成药性有很多参数，经验中比较重要的参数包括IC50（半抑制浓度）、EC50（最大半效应浓度）、化合物在水环境与脂环境间的分配系数等，以初步判断化合物的有效性与安全性。同时，在里宾斯基五规则的一些经验法则指导之下，人们可以舍弃一些从结构上预计成药性差的化合物，选用更少的化合物结构进行细胞实验与模型生物实验。

在先导化合物优化阶段，结构生物学、计算化学的工作人员可以分别从分析实验与理论预测的角度，通过判断化合物分子与靶点蛋白质结合的状态，预测哪些分子结构最适合成为临床候选药物。同时，有较为深厚的药学经验积累合成化学工作者也会建议一些化学结构，优化先导化合物分子的成药性。在这些信息的指引下，药物化学工作者合成毫克级至克级的化合物，供药学工作者采集相关的化合物体外试验、毒理学、药代动力学等数据。最终，相关的先导化合物按照它们的综合表现被顺序排列，最优先的化合物作为临床前候选化合物，进入到后续药物研发阶段。

1.3 药物化学的相关工作模式

在药物发现阶段，药物化学工作的主要目的是以最快的速度合成目标种类数量的化合物。无论是合成供高通量筛选的化合物库，还是合成克级的先导化合物，工作人员的劳动时间是成本的最大贡献者；而药物化学工作使用的原料、耗材等非人力成本，通常占比很小。

在药物化学阶段，人们在工作中通常不用过多考虑产品的纯度与合成路线的经济性。这其中最主要的原因是：人们还不知道大部分化合物能否作为候选药物分子，进入到后续的研发阶段。因此，只要能以最快的速度得到（通常情况下90%纯度以上）的目标量产品，药物化学工作者的工作基本就算完成。因此，合成方法学是药物化学工作的有力工具：很多学界新报道的、未被放大生产检验过的、精妙的合成方法在药物化学工作中被使用。

2.     临床前至临床I期阶段的化学工作（药物化学与工艺化学的交汇）[5]

在人们得到临床前候选化合物的结构信息之后，需要将其进行首次放大生产：因为更多量的化合物需要被用于大型哺乳动物（临床前）与健康志愿者（临床I期）体内，以便获取更多该药物的安全性与有效性信息。在这个药物研发阶段，临床前候选化合物逐渐成为了工艺化学研究人员口中的原料药（API）。临床前研究与临床I期研究所需要的原料药产品的量级在数百克至数公斤的范围内。在药物化学阶段的合成信息将作为工艺化学的知识基础，供工艺化学研究人员使用，以开发放大生产工艺。

2.1 药物化学与工艺化学在药物研究新阶段遇到的新问题

在这个药物开发阶段，制造与质量控制的主题首次被列入主要考虑因素之内。供大型哺乳动物（如鼠）与人使用的药物，在药物的申报资料中需要有明确的质量标准；而且随着临床研究向临床III期乃至于商业化阶段的推进，原料药的质量标准应该不差于前一研究阶段的情况。对于临床前研究与临床I期研究使用的小分子原料药的质量标准控制，各国的药物监管部门均有相关的推荐标准。

除了质量控制要求之外，工艺研发人员在化学方面的考虑还有两方面：1）在药物化学阶段，人们使用的合成路线能否成功地在工厂中放大生产？2）目标原料药分子能否以最有竞争力的成本、保质保量地获得？因此，在这一药物研究阶段的化学相关的工作，涉及到药物化学与工艺化学、理学思维与工程思维的相互交汇。

2.2 化学反应的放大效应与安全性

在这个药物研究阶段，迅速获得目标产量、目标质量的化合物仍是第一要务：因此，解决药物化学合成路线中的影响放大生产的反应步骤与反应条件等问题，是首次放大生产对应的工艺化学的首要技术任务。药物化学过程中使用的反应条件有时太极端或者太剧烈（如150摄氏度以上、摄氏零下78度以下的反应温度），或者使用的试剂在放大生产中太过危险（如叔丁基锂），或者放大反应状态下的不可控因素急剧增多（如卡宾插入反应）：这些明确限制放大生产的因素都要逐个被工艺化学解决。

相关的解决方案包含：更换反应路线，使用适合放大生产的反应条件相应的合成手段；不变换反应路线，使用适合放大生产的试剂；不变换反应路线，使用如流体化学之类的新技术反应装置完成放大生产等。

在变更反应路线与反应条件的同时，人们会通过探究反应过程的安全相关参数（如原料、中间体、产品的DSC[6]与TGA[7]数据；反应整个过程的RC1[8]数据等），判断一个反应在工厂放大生产的过程中，是否有热量/压力蓄积、出现热/压力失控、产生生产事故的潜在风险。如果相关风险存在，人们需要进一步探寻合适的反应路线与反应条件。

2.3 反应过程控制、反应稳定性研究与物料平衡

很多药物化学的反应在体积为50毫升以下的反应瓶中进行，向反应体系中加入物料、温度控制等时间因素均可以忽略不计。而在一个5000升的反应釜中，加入一种物料、将反应体系的温度从室温升至80摄氏度所耗费的时间可能都需要以小时为单位计算。在这种情况下，对于一个在小反应瓶中仅需2至3小时便能完成的反应，放大生产的过程中，可能3个小时仅能完成物料加入与温度控制。在反应耗费时间明显比药物化学阶段更长的条件下，如何判断目标反应已经完成？如何判断得到的产品在更久的反应状态下，是否转化成了其他杂质？因此，工艺化学研究的两个重要概念是：反应过程控制（In-Process Control，IPC）与反应稳定性研究（通常以压力测试[9]的方式展开）。

在工艺化学研究过程中，人们在一个反应过程的不同时间节点对反应体系取样分析；同时，人们对于反应过程中关键的物质（如原料、中间态、产品）进行压力测试，判断相关化合物中整个反应、后处理、纯化阶段的稳定性。根据取样分析结果、压力测试结果获得整个工艺过程的物料平衡、[10]提出相应的工艺控制策略，从而完成相关的反应过程控制。

2.4 工艺路线的经济性考虑

在原料药的首次放大生产阶段，生产目标产物使用的工艺路线成本开始被纳入到CMC业务的综合考虑因素之内。一方面，如果反应路线涉及的步骤数较多、原料价格昂贵，那么首次放大生产相应的物料成本与生产成本就会很贵；另一方面，如果药物分子的临床表现良好，后续原料药需求量会逐渐增大，而首次放大生产使用的工艺路线往往会成为后续更大规模生产的框架。

在原料药首次放大生产阶段，原料药CMC的业务成本占比大致是：研发人员的人力成本仍然占据主要部分，但使用的原料、在工厂生产的设备成本已经占据一个比较重要的部分。

因此，选用尽量经济的工艺路线完成原料药首次放大生产、在后续临床研究阶段不对工艺路线进行明显改动，应该是首次放大生产的工艺研发工作希望看到的最理想的结果。这需要工艺化学与药物化学相关的工作人员协作，通过路线设计与实验尝试，共同优化工艺化学路线。

如果原料药首次放大生产使用的工艺路线在各方面都非常合适，人们能够沿用该路线进行放大生产，直至临床III期研究乃至商业化阶段：工艺路线相关的杂质研究工作将在后续CMC工作中被很大程度节约。在下述的2.5节，我们即将展开讨论。

2.5 杂质研究

我们总是希望使用的药物越纯净越好，因为药物中的杂质有可能给患者带来未知的风险。但是，无论人们通过何种方式获取、精制原料药产品，杂质都会伴随着原料药存在于患者使用的产品中。因此，判断在经过生产、精制之后仍存在于产品中杂质的风险是否可控（即杂质研究），是原料药CMC业务中很重要的一部分内容。

在原料药首次放大生产阶段，人们需要对于原料药产品中可能存在的杂质进行预测、分析、确证。可能存在于原料药产品的杂质包括：原料、工艺路线中涉及到的中间体、使用的试剂与溶剂、反应过程可能伴随的副反应产物、原料药自身降解的产品、杂质降解/衍生的产品等。ICH质量指导原则中，有许多章节涉及到小分子原料药杂质研究的相关内容，这包括但不限于：Q1（原料药稳定性）、Q3（有机杂质、无机杂质、溶剂残留）、Q6（规格设置）、Q11（原料药开发）、M7（基因毒性杂质）等。我们将在本教材的最后，结合相关的ICH指导原则，单独使用一篇文章详述杂质研究的要点。

如果在临床II期至临床III期阶段，人们生产原料药的工艺化学路线与临床前至临床I期阶段使用的工艺化学路线相比，发生了根本性的变化：那么，临床II至III期阶段的原料药产品中的杂质种类、含量等关键信息，预期就会与临床前至临床I期阶段的相关情况产生较大的差异。于是，临床前至临床I期阶段进行的杂质研究工作生成的信息的可用度就会降低，人们要重新对于临床II至III期阶段的工艺路线进行杂质研究：这也是2.4节最后段落的相关解释。

2.6 规范性生产

新药研发过程中涉及到任何供人使用的药品，都要在GMP条件下生产得到，以保证人用药品的质量。GMP的含义为“良好生产规范”（Good Manufacturing Practice），是制药工业在历史上经历一系列质量事故导致的公众卫生事件之后，逐步建立起来的保证药品质量的控制体系。

GMP相对非GMP控制体系的各方面成本都更高一些。对于工艺化学而言，由于合成目标化合物的反应步骤数很长，通常情况下，没有必要从结构非常简单的市售化学品作为GMP生产的起始物料（或者称为注册起始物料，registered starting material，RSM）：从RSM出发合成最终原料药的步骤，人们使用GMP控制体系；而在RSM之前的生产步骤，无需使用GMP控制体系进行生产。对于注册起始物料的定义，ICH Q11指导原则有明确的建议标准；但因为每个原料药的合成路线的情况均有其特殊性，各个国家的药品监管机构对于同一条合成路线的RSM界定都有可能发生不一致的现象。有些国家地区的药物监管机构会允许很复杂的化学结构作为RSM，即从RSM到原料药的合成步骤数相对更短、在各步骤中对于原料药的控制机会相对较少；而有些国家地区的药物监管机构则倾向于批准更简单的化学结构作为RSM，即从RSM到原料药的合成步骤数相对更长、在各步骤中对于原料药的控制机会相对较多。

3.     临床II期至商业化生产阶段的化学工作（工艺化学与工程控制）[11]

伴随着一个原料药产品相关的药品成功进入临床II期、III期乃至于NDA申报成功、进入商业化生产阶段，合成原料药的工艺化学路线会逐渐被优化、固定；人们对于该条工艺化学路线的理解也逐渐深化、成熟。工艺化学研究的重点将更加关注：如何稳定地使用工艺条件通过多批次生产，得到批次与批次之间收率稳定、质量稳定的产品。

为了达成此目的，GMP生产体系要求与工艺生产相关的各因素均需要经历验证过程，这包括但不限于：生产设备验证与设备清洁验证、分析方法验证、生产工艺验证等。因此，在此药物研发阶段的工艺化学的主体研究工作即为：为了使生产工艺成功得到验证，通过QbD实验（Quality by Design，质量源于设计）获得达成原料药关键质量属性（Critical Quality Attribute，CQA）的关键工艺参数（Critical Process Parameters，CPP）。

一般情况下，原料药关键质量属性之中，最受关注的一项仍然是杂质的含量控制。人们在经历了多轮生产过程之后，对于关注的主要杂质的生成、转化、除去规律（Fate and purge）基本有了较为明晰的认知。在这种情况下，人们通过化学逻辑与相关的QbD实验，找到各GMP步骤控制杂质的生成与除去的关键工艺参数（CPP）与关键工艺参数的可接受操作区间（Proven Acceptable Ranges，PAR）；原料药的质量属性中，其他关键质量属性也参照此种方式获取相应的关键工艺参数信息。

在一个GMP生产主体之中，工艺化学团队、分析化学团队、生产团队、质量保证团队相互协作，最终完成原料药生产的各个验证环节；待相应药品监管机构批准申报资料之后，经历各种优化的工艺化学路线终于可以在此生产主体进行商业化资质的生产。

4.     新技术在工艺化学研发中的应用示例

制药工业是有机化学新方法的高频应用场景之一，很多在当时开辟了有机合成新方法学的化学家，在十几年或数十年后拿到诺贝尔奖：其原因就是包括制药工业在内的业界广泛应用了相应的合成方法，通过很多年的业界应用证实了相关方法的便利性与可靠性。如1979年诺贝尔化学奖授予Herbert C. Brown与Georg Wittig，2001年诺贝尔化学奖授予William Knowles、野依良治与Barry Sharpless，2010年诺贝尔化学奖授予Richard Heck、根岸英一与铃木章，2021年诺贝尔化学奖授予Benjamin List与David MacMillan：他们的很多开创性的有机合成方法学大大简化了合成目标分子的难度，节约了相应的人力、物力、以及时间成本；很多人的名字已经将相应的合成反应方法冠名，编入教材之中。

在本篇内容中，我们介绍两种小分子原料药CMC业务领域的热点新技术：连续流反应技术与酶催化转化技术。

3.1 连续流反应技术（Flow chemistry）

连续反应过程对于大化工而言，是基本操作模式。因此，如果在工程角度上考虑，连续反应技术并不是一个新概念。高等教育体系中，化学工程与工艺的学生们学习《反应工程》课程时，会接触到相应的流体反应数学、物理模型。

对于制药工业而言，因为产品的批量比较小，在放大生产上传统使用批次反应模式。在设计合成路线的时候，人们往往可以通过使用适合批次反应放大的反应形式规避、或者绕开那些不适合批次放大生产的反应：如自由基反应、卡宾插入反应、使用丁基锂的深冷反应等。但是，如果一些反应形式能够很大程度地简化反应过程、降低路线的总成本，那么使用连续流反应技术配合相应的反应形式，是提高工艺路线效率的一个好方法。

下面对一个连续流反应技术在制药工业中的应用进行举例。国际制药公司阿斯利康在原料药Ceralasertib（AZD6738）的一个关键中间体的合成过程中，若使用传统批次反应技术，需要耗费四步反应转化过程：[12]

如果使用光敏化条件下的Minisci反应，则可以将工艺路线缩减为两步：[13]

Minisci反应的关键中间体是自由基：如果使用批次反应形式完成，生成自由基的过程、自由基形成之后与嘧啶底物反应的过程均不可控。使用透明的连续流反应器，自由基在450 nm的蓝光照射下生成，随即在微小的反应空间内与嘧啶底物进行反应：这样，自由基中间体的生成与后续反应均得到有效控制。此连续光反应成功地得到了百克级的放大生产结果。

迄今为止，适合连续流生产模式的新型反应形式正不断地被制药工业采纳，连续流反应技术正越来越多地应用在小分子CMC业务领域之中。基于此，ICH在2021年底新进推出了连续生产技术的指导原则（征求意见稿，ICH Q13），以更好地规范工艺路线中包含连续流生产模式的小分子新药的制造过程。

3.2 酶催化转化技术

药品供人使用，以改善人体内的生物化学过程、达到治疗疾病的目的；天然的药用化合物本身，也是自然界的生物通过生物酶转化过程产生的。近年来，分子生物学的研究成果也不断地向小分子原料药的CMC业务领域提供贡献，使传统有机化学与分子生物学之间的界限变得模糊。

生物相关的物质绝大部分都自带手性；而生物酶催化转化过程在经历优化之后，往往也会给底物带来手性选择性非常好的转化效果。在贵金属催化剂的成本逐渐提升的大背景下，在小分子原料药的合成路线中使用酶催化转化技术，从各方面评判标准看来，都越来越有竞争力。

在小分子原料药CMC领域，工艺化学路线使用的常见的生物酶工具包括（但不限于）：脂肪酶（Lipase）、转氨酶（Transaminase）、酮还原酶（Ketoreductase）、单加氧酶（Monooxygenase）等。我们使用与3.1节同样的原料药分子，阿斯利康的原料药Ceralasertib（AZD6738）为例，看一步酶催化转化过程如何应用在原料药的工艺化学路线中。

在Ceralasertib的药物发现阶段，合成的目标中间体的硫氧键带有手性，[14]在后续的转化过程中需要进行手性分离，获得目标构型的化合物

使用单加氧酶（BVMO）与酮还原酶（KRED）的组合可以选择性地得到目标构型的产品，[15]从而使所有底物的目标转化产品为手性纯的产品，进而提高整个工艺路线的经济性。

为制药工业供应催化活性强、手性选择性好的各种酶转化工具，是分子生物学的一个研究热点。对于一类反应而言，同一种生物酶对于不同化学结构的底物的催化活性、选择性可能有很大的不同。人们可以将相关的酶进行结构上的不断优化，以提升酶工具在特定底物的反应过程中的表现：生物酶的定向进化（Directed evolution）就是生物酶的一种重要的优化方法。[16]2018年，诺贝尔化学奖的一半奖金被授予了加州理工大学的Frances Arnold教授，以表彰她在生物酶的定向进化领域的贡献。

[1] https://www.bilibili.com/read/cv16179215

[2] 维基百科：组合化学

[3] “DNA-encoded chemical libraries.” Nat. Rev. Methods Primers 2022, 2, 3

[4] 维基百科：Hit to lead、IC50、EC50、里宾斯基五规则

[5] 更多信息参见：尼尔·安德森《有机合成工艺研究与开发》，陈芬儿主译，原著第二版

[6] 差示扫描量热法（Differential scanning calorimetry）

[7] 热重量分析（Thermal gravimetric analysis）

[8] 反应量热（Reaction calorimetry）

[9] 对反应过程中的各阶段进行工艺约束关键参数的上限或下限（甚至略超过上限或下限）的运行状态测试，判断在极端工艺条件下，工艺操作是否能够达成预期目的

[10] 原料有多少没有被转化、多少转化为产品、多少转化为杂质；产品有多少损失在纯化过程中、多少继续转化为杂质、多少被最终得到等信息

[11] 更多信息参见ICH Q7（原料药GMP生产）、Q11（原料药开发）指导原则

[12] Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 43-56

[13] Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 57-67

[14] J. Med. Chem. 2018, 61, 9889-9907

[15] Org. Process Res. Dev. 2021, 25, 43-56

[16] 维基百科：Directed evolution