【中英双字 | 1080P】蛋白质印迹 Western Blotting （WB
能检测目标蛋白的变化如浓度、 小的化学修饰，以及和其他蛋白相互作用的变化
弱去垢剂提取细胞内水溶性蛋白而不破坏细胞内的有膜结构，强去垢剂获取所有膜结构内的蛋白质
上清液 supernatant-protein lysate
沉淀pellet
裂解在低温和各种酶抑制剂的环境中进行，以防不想要的修饰等
几种protein lysate：
whole cell lysate， nuclear lysate，cytoplasmic lysate
IP- immunoprecipitated ——筛选与目标蛋白相互作用的蛋白质：
抗体加入识别靶蛋白，再加连到beads上的二抗以从裂解液沉淀，蛋白质抗体复合物
1.PAGE电泳
2.转膜
用特异性抗体可视化观察目标蛋白
PAGE分为
非变性/天然non-denaturing PAGE——可以评估蛋白是否有带电荷的化学修饰和其他分子或者蛋白的结合以及蛋白质的四级结构
denaturing/SDS PAGE——仅仅靠质量，SDS阴离子去垢剂使蛋白质变性并且均匀地带上负电荷。可以用来评估影响蛋白质质量的变化如共价修饰或者表达量的改变。
电泳缓冲液遍布整个腔室，用于在凝胶内运行样品。样品上样缓冲液（多含溴酚蓝）是我们在将样品上样到凝胶中之前与样品混合的缓冲液。running buffer and sample loading buffer
电泳缓冲液是加入电泳槽的，tris、甘氨酸缓冲液。样品缓冲液就是loading buffer，处理蛋白样品的，分离胶缓冲液是配制分离胶的tris-hcl ph8.8。
transfer
转膜后进行杂交印迹
- 电洗脱法- electroelution
聚丙烯酰胺凝胶直接和硝化纤维膜，或者其他惰性的能结合蛋白质的物质相接触，并将两者浸没在一个充满缓冲液的容器中。
负电极位于最靠近凝胶的地方，正电极位于最靠近膜的地方。
通过抗体作为探针标记（membrane is probed with an antibody），膜能准确识别感兴趣的蛋白质、特定残基或化学修饰
blocking
膜对于蛋白质亲和力很高（包括抗体），因此要先尽量减少非特异性抗体结合
通过含有blocking agent的溶液如奶粉结合空出的区域，防止抗体非特异性结合
洗膜
随后置于含有blocking solution和一抗的溶液中 incubate，然后用 washing buffer在轻微晃动mild agitation下进行洗涤。washing buffer有着和 blocking solution中一样的温和洗涤剂以便去除非特异性结合的一抗
二抗结合（便宜）
和二抗一起 incubate，同样要有 blocking solution 和洗涤
二抗和reporter enzyme或者荧光基团 fluorophore 结合以便可视化
提高了可视化检测的灵敏度，因为多个二抗分子可以和同一个一抗结合
最常用的二抗和辣根过氧化物酶结合，可以催化产生光（副产物）的反应，光的产生量直接和二抗结合数量成正比
最常见的记录光输出的方法是使用X射线胶片，其放在添加了底物的膜顶部，增加曝光时间会产生更强的信号，但是也会增大 noise（ 指在发生、检查、测量或记录系统中与信号存在与否无关的一切干扰。）
