Biomaterials | Au纳米粒子可靶向自噬-溶酶体系统对抗炎症反应

牙周炎是一种普遍的慢性炎症疾病，病情严重时会导致牙齿脱落，严重影响口腔功能和患者的健康。目前的临床治疗方法可以限制疾病的进展。虽然从无数成人组织中分离出来的干细胞的安全性和有效性已经在人工牙周缺陷的动物模型中得到验证，但它们在临床上用于患者的再生目的基本上没有达到预期效果。一个主要原因是，当干细胞被应用于牙周病变部位时，由于周围的炎症条件，它们无法发挥正常的多能性或再生潜力。

自噬是一个发生在所有真核细胞中的基础水平的分解代谢过程﹐被公认为参与了一系列的细胞事件，如细胞分化和生存。最近，自噬调节机制进一步被证明在炎症、缺氧和营养匮乏期间对维持细胞的生态平衡和生存至关重要。越来越多的证据表明，适当的自噬活动是确保适当的细胞成骨分化的先决条件。尽管有研究已经初步研究了PDLSCs的自噬活性如何在体外炎症刺激下促进其成骨分化，但与炎症诱导的细胞变化相关的细胞自噬机制以及调节细胞成骨的自噬下游的决定因素在很大程度上仍然未知。

2022年8月14日，第四军医大学口腔医院陈发明教授作为通讯作者在《Biomaterials》（IF=15.304）杂志上发表了题为“Gold nanoparticles targeting the autophagy–lysosome system to combat the inflammation-compromised osteogenic potential of periodontal ligament stem cells: From mechanism to therapy”的研究论文，揭示了炎症影响下的自噬和细胞成骨的下游机制。值得注意的是本研究中使用到了汉恒生物的自噬双标腺病毒产品。

接下来，让我们一起来了解一下这篇文章吧。

首先，作者将从捐赠的人牙齿中分离和纯化的PDLSCs细胞，在正常培养基和炎症培养基中进行培养。并测试了自噬水平在炎症条件下PDLSCs不同时间段自噬水平的变化情况。基于自噬相关蛋白的表达，在168小时内测试了PDLSCs的自噬水平变化。作者发现，在炎症条件下，PDLSCs的自噬在大约12或24小时内被暂时激活。在炎症刺激72小时后，自噬在PDLSCs中逐渐被抑制。为了避免短期（少于72小时）培养引起的瞬时自噬激活的干扰，并研究炎症的相对长期影响，作者在炎症条件下预刺激PDLSCs（IPDLSCs） 7天，一个平行的7天正常培养的细胞作为对照(PDLSCs)。PDLSCs和IPDLSCs的干细胞特征(在7天的预刺激期后)使用流式细胞仪、集落形成试验、以及其他方法（流式细胞仪、集落形成试验、CCK-8试验、脂肪生成和软骨分化试验）进行测量。两个细胞系都表现出了形成细胞克隆的能力，虽然IPDLSCs形成的数量（第14天）明显较低。PDLSCs和IPDLSCs都显示了脂肪生成的多种分化潜力，或软骨生成的多种分化潜力，在IPDLSCs成骨能力明显低于PDLSCs。

图1. 炎症条件下培养PDLSCs会损伤其成骨潜力

接下来，为了研究PDLSCs在成骨分化过程中的自噬水平，根据PSLSCs和IPDLSCs中自噬相关蛋白（SQSTM1, LC3 II and BECN1）表达随时间的变化情况，测量了成骨诱导后细胞自噬激活的起始和停止时间点。结果发现自噬激活发生在PDLSCs成骨分化早期阶段，这一点由LC3 II 和 BECN1的表达增多，SQSTM1的表达量减少所证实。IPDLSCs的自噬激活也显示出类似的趋势。在成骨分化过程中，自噬的激活也显示出类似的趋势；LC3 II的表达显著增加，而SQSTM1的表达减少。在PDLSCs和IPDLSCs的细胞质中都观察到自噬体样结构。选择了PDLSCs和IPDLSCs中自噬蛋白表达的比较，相较于PDLSCs， SQSTM1水平的增加、BECN1水平下降表明IPDLSCs自噬水平较低。然而，IPDLSCs在成骨诱导的6-24小时内表达的LC3 II更多。作者又测量了PDLSCs和IPDLSCs的自噬通量。在成骨分化过程中，IPDLSCs在6小时和12小时内表现出的自噬通量比PDLSCs低得多。在腺病毒mRFP-GFP-LC3实验中也观察到类似的结果。

图2. 炎症条件下培养的PDLSCs在成骨诱导过程中表现出自噬水平的下降

基于IPDLSCs中自噬水平的下降和自噬通量的抑制，作者推测自噬溶酶体系统是PDLSCs的炎症损害的限制因素。通过LC3、LAMP1的共定位来测量自噬体-溶酶体的融合，发现IPDLSCs的LC3和LAMP1的同聚程度比PDLSCs低得多，表明在成骨分化过程中，12小时内LC3和LAMP1的共定位程度低于PDLSCs（P<0.01），IPDLSCs的自噬体-溶酶体融合受到影响。溶酶体的降解功能在IPDLSCs中被抑制了，IPDLSCs中的SQSTM1点的数量增加、SQSTM1点状的积累减少证明了这一点。一个流畅的自噬过程和依赖溶酶体的降解是由一个主调控器（TFEB）和另一个主调控器的协调决定的。因此，作者还测量了TFEB的激活情况，结果TFEB在IPDLSCs细胞核中的表达减少，证实了TFEB在IPDLSCs中的激活受到抑制。此外，用qRT-PCR自噬相关的（MAP1LC3B，BECN1，和SQSTM1）和溶酶体相关基因（CTSB、HEXA和LAMP1）的表达。与PDLSCs相比，IPDLSCs表达较少的MAP1LC3B。这些结果表明，炎症条件导致自噬-溶酶体系统的功能障碍，表现为自噬体和自溶体的融合受到抑制，溶酶体的功能受到损害，并抑制了TFEB的激活和表达。

图3. 炎症条件导致自噬-溶酶体系统的功能障碍

为了确定自噬-溶酶体系统在炎症诱发的PDLSC成骨潜能损伤中的作用。作者在IPDLSCs中通过慢病毒过表达TFEB以激活细胞的自噬-溶酶体系统。在IPDLSCs中转染LV对照组相比，在IPDLSCs中转染LV-TFEB后，TFEB的表达水平从12%提高到了20%。在成骨诱导后12-72小时内，TFEB的表达水平显著提高。在IPDLSCs中TFEB的过表达明显诱导了IPDLSCs的自噬激活。在成骨诱导后12和24小时内，BECN1的增加、SQSTM1的减少表明了这一点。通过茜素红S染色和Western blot分析，测量了TFEB过表达对IPDLSCs成骨潜能的影响。结果发现，TFEB在IPDLSCs中的过表达促进了IPDLSCs的成骨潜能，具体表现为在IPDLSCs中过量表达TFEB可以促进IPDLSCs的成骨潜能，表现在Alizarin Red S染色的矿化结节的形成增加和成骨蛋白的表达量增加。

图4. TFEB的过度表达可促进IPDLSCs的成骨潜能

最后，作者通过实验摸索了Au纳米粒子处理IPDLSCs的浓度为0.01 nM。检测了Au纳米粒子处理IPDLSCs后对自噬和自噬通量的影响情况。结果发现，在成骨诱导的早期阶段（6至72小时）Au纳米粒子处理并没有改变I-DLSCs中LC3 II的表达。然而，Au纳米粒子处理增加了IPDLSCs的自噬通量，表现在LC3 II的积累明显增加（与Baf处理相比，细胞中的LC3 II水平增加）。腺病毒mRFP-GFP-LC3也检测到了一致的自噬通量变化趋势。这些结果表明，经Au纳米粒子处理的IPDLSCs的自噬通量增加。

为了进一步验证Au NP诱导IPDLSCs成骨潜能拯救自噬-溶酶体机制的作用，在成骨诱导的早期阶段，作者分别使用siRNA-TFEB和3-MA来抑制Au纳米粒子诱导的自噬激活的IPDLSCs，并评估IPDLSCs的自噬水平和成骨潜力。结果发现，siRNA-TFEB的应用显著抑制了TFEB的表达和Au纳米粒子处理的自噬水平（由BECN1水平下降和SQSTM1水平上升确定）。此外，在Au纳米粒子处理的敲除TFEB的IPDLSCs中抑制了Au纳米粒子诱导后拯救的Alizarin Red S染色的钙结节形成。3-MA处理也得到了一致的结果。

图5. 敲除TFEB抑制了Au 纳米粒子介导的自噬水平和对IPDLSCs的成骨潜力的拯救

总之，本研究首次在细胞器层面上揭示了炎症损害的PDLSCs在细胞器水平上的机制，也证明了自噬-溶酶体系统在炎症损害的PDLSCs成骨过程中的关键作用。并进一步验证自噬-溶酶体系统参与了炎症介导的自噬活性受损和随后的PDLSCs成骨分化。同时，本研究结果也表明了Au纳米粒子作为一种纳米材料工具，可能是治疗炎症受损细胞的一条新途径。