USP7小分子抑制剂干扰泛素的结合
写在前面
今天推荐的是由美国加州Genentech公司团队在2017年8月18日发表于Nature（IF：42.475，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Ingrid E. Wertz博士，研究表明USP7小分子抑制剂干扰泛素的结合。
研究背景
泛素系统调控真核生物的基本细胞过程。泛素以单体或链的形式连接底物蛋白，泛素修饰的拓扑结构调节底物与特定蛋白的相互作用。因此，泛素化指导了各种底物的命运，包括蛋白体降解。去泛素酶从底物上裂解泛素，并与疾病有关；例如，泛素特异性蛋白酶-7（USP7）调节p53肿瘤抑制因子和其他对肿瘤细胞生存至关重要的蛋白的稳定性。然而，开发选择性的去泛素酶抑制剂一直是个挑战，而且还没有解决小分子抑制剂的共晶体结构。
摘要部分
在这里，利用基于核磁共振的筛选和基于结构的设计，作者描述了选择性USP7抑制剂GNE-6640和GNE-6776的开发。这些化合物能诱导肿瘤细胞死亡，增强化疗药物和靶向化合物的细胞毒性，包括PIM激酶抑制剂。结构报告显示，GNE-6640和GNE-6776以非共价方式靶向USP7，距离催化半胱氨酸有12 Å。这些化合物削弱了泛素的结合，从而抑制了USP7脱泛素酶的活性。GNE-6640和GNE-6776与介导与泛素Lys48侧链的氢键相互作用的酸性残基相互作用，这表明USP7优先与具有自由Lys48侧链的泛素分子相互作用并进行切割。作者通过设计含有不同的近端和远端同位素标签的双泛素链并通过核磁共振测量USP7的结合来研究这一观点。这种优先结合延长了Lys48连接的泛素链相对于Lys63连接的链的解聚动力学。总之，通过减弱泛素结合来抑制USP7活性的工程化合物为开发其他去泛素酶抑制剂提供了机会，并且可能是一种更广泛适用于抑制需要泛素结合才能发挥全部功能的蛋白质的策略。
研究内容
1.USP7抑制剂的鉴定和特征分析
USP7是一种经基因验证的MDM2的去泛素酶，MDM2是一种促进肿瘤抑制因子p53降解的泛素连接酶。剥夺USP7会增强USP7底物的泛素化，包括MDM2。随后的MDM2蛋白体降解可稳定p53，从而促进细胞周期停滞和凋亡。
为了确定USP7抑制剂，作者建立了一个基于活性的高通量筛选级联。同时，作者开发了一个核磁共振（NMR）筛查，以确定USP7催化域的结合片段。选择性试验和结构生物学在级联的顶端指导药物化学设计。测量总的和泛素化的MDM2水平的试验被用作USP7活性的近端指标，然后用匹配的化学系列的非活性化合物作为阴性对照进行生存能力试验。
通过对母体片段GNE-2916的优化产生了GNE-6640和GNE-6776。这些USP7抑制剂增强了内源性MDM2泛素化，同时实现了对USP47和USP5的选择性。因此，GNE-6640和GNE-6776，能促进内源性MDM2与Lys48（K48）连接的多聚泛素链的泛素化，从而指导蛋白酶体降解。活跃的USP7抑制剂稳定了p53，并在野生型细胞中上调了p21，但在p53缺失或USP7缺失的细胞中却没有。因此，证明GNE-6640和GNE-6776针对细胞USP7、MDM2和p53信号通路。
研究结论：利用基于核磁共振的筛选和基于结构的设计，筛选到了USP7抑制剂GNE-6640和GNE-6776。
2.USP7抑制剂的选择性以及与PIM激酶抑制的协同作用
鉴于这些抑制剂的有利特点，作者研究了它们在动物模型中的疗效。在确认了GNE-6640和GNE-6776的选择性，细胞活性及其口服利用率之后，作者在3天的存活率试验中预选了441个细胞系，研究发现GNE-6641在5天的存活率实验中仍然没有活性，而GNE-6640和GNE-6776分别降低了54个和6个细胞系的存活率，IC50≤10μM。
尽管这两种化合物在TP53野生型细胞系中都降低了增殖和激活了caspases，但在TP53缺失型细胞系中，这些效应有所降低。将GNE-6640与多柔比星或顺铂结合使用，可增强USP7抑制剂的功效。因此，MDM2或p53途径是GNE-6640和GNE-6776细胞活性的媒介，但不是唯一的决定因素。另一方面，作者发现GNE-6640与破坏DNA的药物联合使用的疗效增强，这表明了一种确定与USP7抑制相交的信号通路的策略。
在机理研究中，GNE-6776促进了AML细胞系中p21水平的升高，而PIM2水平则降低。抑制泛素激活酶UAE1或蛋白酶体抑制剂硼替佐米可以挽救GNE-6776引起的PIM2水平下降。在USP7缺失的细胞中，PIM2的水平较低，这被蛋白酶体的抑制所回补，共同表明USP7通过泛素和蛋白酶体依赖的机制稳定PIM2的水平。
用GNE-6776、GDC-0570或这两种化合物处理的时间过程显示，GDC-0570减少了Bad和S6的磷酸化，降低了短寿命蛋白p21和Mcl-1的表达。GNE-6776减少了PIM2的水平。GNE-6776和GDC-0570的联合处理增强了聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）和caspase-3的裂解，从机制上证实了细胞活力的研究。因此，作者推测PIM2是USP7的底物。为了支持这一观点，内源性USP7和PIM2共同免疫沉淀，GNE-6776处理增强了PIM2泛素化。重组的USP7，在体外使PIM2去泛素化。因此，同时抑制PIM激酶和USP7抑制剂介导的蛋白质降解比单独的任何一种处理都更能拮抗PIM的活性和细胞生存能力。这些数据揭示了USP7和PIM信号之间的串扰，扩大了USP7调节的致癌途径的范围。
研究结论：USP7通过泛素和蛋白酶体依赖的机制稳定PIM2的水平，PIM2是USP7的底物。
3.USP7抑制剂与泛素结合的USP7竞争
鉴于GNE-6640和GNE-6776的选择性和有效性，了解这些工具化合物抑制USP7的分子机制是有意义的。作者通过酶学研究验证了通过削弱底物结合实现对USP7内在活性的抑制。将GNE-6776和GNE-6640与USP7泛素复合物的共晶体结构进行比较，发现这些化合物立体地抑制了泛素的结合，并阻止了USP7催化结构域KG5螺旋向活性构象的转变。鉴于USP7催化结构域和泛素5之间的广泛相互作用，作者调查了与泛素K48侧链相互作用的USP7残基的重要性。通过点突之后的相互作用分析，作者证明泛素-K48和USP7-D305/E308残基对于USP7泛素结合和底物去泛素化至关重要。
研究结论：USP7抑制剂与泛素结合的USP7竞争，泛素-K48和USP7-D305/E308残基对于USP7泛素结合和底物去泛素化至关重要。
4.USP7促进PHF8稳定的生物学功能
GNE-6640和GNE-6776的结合模式表明，USP7可能优先与具有自由K48侧链的泛素分子结合。从机制上讲，这可能将USP7引向K48连接的聚泛素的远端亚单位，导致从远端到近端链的顺序解聚（外裂）。为了评估这个想法，作者设计了K48和K63连接的双泛素，使用光谱学上不同的氨基酸对远端和近端泛素亚基进行不同的标记。核磁共振分析显示，USP7催化域优先与K48连接的二泛素远端亚单位结合，而USP7催化域与近端和远端K63连接的二泛素亚单位的结合情况相似。D305A USP7和D305A/E308A USP7催化域突变体都表现出与近端和远端K48连接的二泛素亚基的类似结合。
在这些数据的基础上，作者评估了不同的二泛素结合是否会影响USP7解聚泛素链的动态。USP7裂解K6、K11、K33、K48和K63连接的二泛素的kcat和Km值相似，表明不同的异肽键构象不会对裂解效率产生实质性影响。作者的研究显示，USP7从远端残基开始依次解聚四-K48连接的泛素（外裂解），而四-K63泛素链则通过外裂解、内裂解或基底裂解的组合进行裂解。
研究结论：USP7优先结合具有自由K48侧链的泛素分子，导致K48连接的聚
结论与讨论
研究显示，USP7脱泛素酶活性和PIM激酶在调节细胞活力方面有未报道过的交叉点。突变分析证实了GNE-6640或GNE-6776的共晶体结构，指出了USP7-D305/E308和泛素-K48侧链之间互补电荷作用的重要性。同时，作者通过核磁共振分析显示，USP7优先与具有自由K48侧链的泛素分子相互作用。开发削弱泛素结合的选择性抑制剂是抑制USP7的一个有效策略。作者的研究证明了这种方法的可行性，它可能在抑制其他类别的泛素结合蛋白方面有更广泛的应用。
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原文链接：https://www.nature.com/articles/nature24006
