石蜡切片免疫荧光双标-TSA
之前发过几期免疫荧光的推文，介绍了一些基本的原理和一些实验步骤，不过之前发的是荧光标记二抗的步骤，今天再发一期基于TSA技术的石蜡切片免疫荧光双标。回顾请点击：石蜡切片免疫荧光多标
01基本原理
酪酰胺信号放大(TSA，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。
此技术的主要原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应（即荧光标记的酪胺盐在HRP催化H2O2 下形成共价键结合位点），产生大量的酶促反应，该产物能与周围的蛋白残基（包括色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基）结合，在抗原-抗体结合部位形成大量的荧光素沉积，实现信号放大。还可以通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现多重荧光染色。
简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。
然后微波处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。
02优势
首先当然是信号放大啦，TSA技术可以用于检测用传统方法无法检出的低丰度靶标。基于酪酰胺的信号放大技术能够提供极强的敏感度、检测极微量的目的抗原。
其次是省心，由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，同源异源都一个步骤，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。但是节约不了时间，每个一抗都是要4°过夜孵育的。
再次是能大大节约一抗，因为是信号放大技术，为避免背景荧光过强，所以一抗稀释比是常规建议稀释浓度的5-10倍。
最后是能实现多重荧光标记，可同时进行五个颜色通道以上，这是传统间接荧光法染色和显色法多重免疫组化所做不到的。这种方法能真实反映关键蛋白的表达情况和相互之间的关系，从而极大地节约珍贵的样品。
03实验步骤
具体步骤为图片（下载看更清晰）
注意事项
1. TSA试剂室温融化后，使用离心机进行短暂离心，干净吸头吹吸混匀后取用。
2. 与荧光二抗相比，TSA试剂盒有更高的灵敏度和更强的信号。因此一抗使用浓度需降低，一般在抗体说明书建议的稀释比基础上再扩大5-10倍，以减少非特异性结合导致的背景荧光。建议设置一抗梯度浓度获得最佳效果。
3. 如背景荧光较强，建议增加组织自发荧光淬灭步骤。
4. 荧光Tyramide的建议稀释比是1:500，可根据实验结果调整稀释比例（建议稀释比例范围1:200 - 1:1000）。
5. 如进行多重荧光标记，建议先孵育多抗，后孵育单抗；先孵育低丰度目的蛋白对应的抗体，再孵育高丰度目的蛋白对应的抗体。
6. 表达最强的指标用最弱的荧光，Cy3强于FITC，所以最强的用FITC 标记；
7. 表达弱的先标记，即在加抗体时Cy3标记的最先加进去，防止串光；
8. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。
常见荧光通道
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