双通道逆转癌症对索拉非尼的化疗耐药！基于铁死亡诱导的纳米反应器！
化疗作为全身转移倾向肿瘤或转移性晚期肿瘤的主要临床治疗方法，一般通过使用化学药物抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗效果。然而，肿瘤细胞对一种或多种化疗药物产生耐药性的途径有很多，包括减少药物摄取或增加药物外排、激活DNA修复、上调新陈代谢、刺激解毒途径等，从而成为传统化疗成功的主要障碍。
随着耐药研究的深入，肿瘤异质性、肿瘤微环境、遗传因素等多种机制与化疗耐药的发生密切相关。最近，细胞内活性氧(ROS)失衡被报道与耐药有关。当肿瘤细胞的氧化还原水平被打破时，其氧化应激防御能力可以通过上调谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx4)和谷胱甘肽(GSH)的水平而显著增强。肿瘤细胞内的微环境通过迁移有毒的活性氧，重新达到稳定状态，从而逐渐导致肿瘤细胞产生耐药性。因此，积极改变肿瘤细胞内的氧化环境是逆转肿瘤耐药的有效策略。
铁死亡是一种细胞内铁依赖的细胞死亡形式，与氧化应激的产生有关。铁死亡时脂质过氧化(LPO)的积累破坏了细胞内氧化还原动态平衡，从而影响肿瘤细胞对药物的敏感性。因此，来自南京工业大学的宋雪娇、董晓臣和南京医科大学的徐华娥共同提出了一种基于LPO积聚的铁死亡策略，通过抑制SLC3A2蛋白和失活的谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)来减少谷胱甘肽的生成，以逆转癌细胞的化疗耐药性。基于铁死亡诱导纳米反应器(Au/Fe-GA/Sorafenib@PEG)的芬顿反应不仅在激光照射下产生羟基自由基(·OH)实现LPO的积累，而且还耗尽GSH以增加LPO的积累。同时，索拉非尼抑制细胞对半胱氨酸的摄取，导致GSH合成减少，Gpx4失活。体外和体内实验表明，AFG/SFB@PEG+激光组可以灭活Gpx4，增强的铁死亡可以通过自救逆转由于细胞内Gpx4水平持续上调而导致的化疗耐药性。本研究提出了铁死亡逆转耐药的机制和可行性，为化疗耐药肿瘤的治疗提供了一种有前景的策略。相关论文“Potent nanoreactor-me diate d ferroptosis-based strategy for the reversal of cancer chemoresistance to Sorafenib ”于2023年2月1日发表于杂志《Acta Biomaterialia》上。
1. AFG/SFB@PEG的合成与表征
如方案1 a所示，合成了AFG/SFB@PEG纳米反应器。用动态光散射(DLS)和扫描电子显微镜(SEM)对AFG/SFB@PEG纳米反应器的尺寸和形貌进行了表征，如图1a和b所示。与HAuCl4·3H2O和Au/Fe相比，AFG和AFG/SFB@PEG在整个可见光和近红外区域都有很强的吸收，600 nm处的特征吸收峰可能是由于Fe-GA络合物的d-d电子跃迁(图1c)。此外，通过Zeta电位测试(图1d)，成功地合成了AFG/SFB@PEG。此外，用X射线光电子能谱(XPS)测定了Fe的化学组成和价态。AFG/SFB@PEG的XPS分析显示出可归属于Fe、F、O、N、C、Cl和Au的特征峰(图1e)。此外，Fe 2p的XPS谱在711.28 eV和724.97 eV附近出现两个较强的峰，分别对应于Fe 2p3/2和Fe 2p1/2，可归因于Fe3+(图1f)。如图1g所示，Fe-GA和AFG/SFB@PEG分别照射在808 nm激光(1W/cm2)上。经过五个循环的加热和冷却操作，升温速度和最高温度没有明显下降，这表明Fe-GA和AFG/SFB@PEG具有很高的光稳定性。如图1h&i所示，当加入过氧化氢时，AFG和AFG/SFB@PEG显示出典型的·OH特征峰1：2：2：1。
方案1 AFG/SFB@PEG纳米反应器的合成
图1 AFG/SFB@PEG纳米反应器的表征
2. AFG/SFB@PEG体外抗肿瘤作用的研究
进一步研究AFG/SFB@PEG对4T1乳腺癌细胞摄取的有效性，样品系列均用Ce6标记，并在激光共聚焦扫描显微镜分析(CLSM)前与4T1细胞孵育1、2和4h。Ce6的强红色荧光强度可以随着时间的延长而观察到，这表明AFG/SFB@PEG有效地被细胞摄取(图2a)。然后，用标准的细胞存活率分析细胞内铁死亡引起的氧化应激对细胞活力的影响。T1细胞分别与AFG和AFG/SFB@PEG共同孵育。在无激光照射的情况下，AFG处理的细胞存活率低于AFG/SFB@PEG处理组，表明索拉非尼的化疗作用。值得注意的是，激光照射的AFG/SFB@PEG组在所有试验浓度下都表现出比AFG组更高的细胞毒效应，甚至在60 μg/mL的浓度下杀死了大约74%的癌细胞(图2b&c)。图2d的结果表明，AFG具有芬顿效应，与对照组相比有一定程度的细胞杀伤作用。
图2 AFG/SFB@PEG体外抗肿瘤作用的研究
3. 体外铁死亡分析
进一步评估了AFG/SFB@PEG触发的癌细胞的氧化应激。为了定量评价不同处理对GSH和NADPH的消耗、GSH浓度和NADPH浓度。与对照组或其他处理组相比，AFG/SFB@PEG+L处理的4T1细胞的GSH和NADPH浓度显著降低(图3a和b)。如图3c所示，AFG/SFB@PEG+L处理细胞后，细胞内GSH相关Gpx4的活性明显受到抑制，表明AFG/SFB@PEG可以调节Gpx4的表达，并诱导细胞内铁死亡。由于铁死亡不同于一般的细胞死亡形式，如细胞凋亡、自噬等，激光治疗后细胞中Bcl-2蛋白的表达减少，从而促进细胞的凋亡(图3g)。随后，进一步评估了AFG/SFB@PEG对细胞磷脂的氧化应激作用。倒置荧光显微镜显示了AFG/SFB@PEG+L处理4h内增强的细胞DCF荧光信号(图3h)，说明了ROS的产生。此外，AFG/SFB@PEG在808 nm激光下加速了外源ROS的产生，这可能直接对线粒体产生强烈的氧化应激，导致线粒体功能障碍(图3i)。如图3d所示，AFG/SFB@PEG+L处理的细胞产生的丙二醛含量是对照组的3.88倍，表明LPO的积累激活了铁死亡。此外，与对照组相比，Liperfluo染料染色的各组细胞均能发出绿色荧光，证明LPO能在细胞内有效积聚(图3j)。为了进一步评估LPO的产生，在AFG/SFB@PEG处理后，用LPO抑制剂Lip-1与细胞孵育，图3e观察到氧化应激引起的细胞损伤明显减少。此外，添加维生素E(VE)处理细胞，由于VE清除脂质过氧化自由基的能力，可以减轻AFG/SFB@PEG引起的细胞损伤(图3f)。所有这些结果证实了癌细胞内积累的ROS主要是AFG/SFB@PEG诱导的LPO。
图3 体外铁死亡分析
4. 体内铁死亡分析
如图4a和图4b所示，在808 nm激光照射下，注射AFG/SFB@PEG的小鼠肿瘤部位的温度可达48℃，而对照组的温度仅为29℃。在治疗期间，所有小鼠的体重变化均可忽略不计，证实了这些治疗对小鼠健康的负面影响可以忽略不计(图4c)。连续16天观察各组肿瘤生长情况，并于图4d显示抗肿瘤作用。取小鼠肿瘤组织，苏木精-伊红(H&E)染色，验证不同治疗方法对肿瘤组织的损伤情况。与未经激光照射的肿瘤相比，AFG+L组和AFG/SFB@PEG+L组的肿瘤组织切片显示细胞完整性不全，表明肿瘤细胞损伤严重(图4e)。
图4 体内铁死亡分析
5. 体内和体外铁死亡逆转化疗耐药
如图5a和b所示，用四甲基偶氮唑蓝比色法证实，SMMC-7721细胞经索拉非尼作用后，半数抑制浓度(IC50)值升高，表明该细胞对索拉非尼诱导的化疗具有耐药性。为了定量地证明铁死亡可以通过下调GSH和Gpx4来逆转肿瘤耐药性，分别定量检测了索拉非尼和AFG/SFB@PEG药物处理的SMMC-7721S细胞中GSH、NADPH和Gpx4的浓度(图5c和e)。如图5f&g所示，经索拉非尼处理的SMMC-7721s细胞表现出较高的P-gp和Gpx4蛋白表达，而AFG/SFB@PEG处理的SMMC-7721s细胞P-gp和Gpx4蛋白表达因AFG/SFB@PEG引起的铁死亡而下调。此外，还进行了体内实验，以验证铁死亡可以逆转化疗耐药。AFG+L或AFG/SFB@PEG+L组小鼠肿瘤体积缩小，与其他组相比，AFG/SFB@PEG+L组肿瘤体积缩小更明显(图5h&i)。值得注意的是，结合免疫印迹和免疫荧光图像分析(图5j和k)，P-gp和Gpx4蛋白在索拉非尼治疗的肿瘤组织中在实体瘤治疗16天后高表达。免疫荧光图像显示，索拉非尼治疗的肿瘤组织中SLC3A2蛋白的表达明显低于其他治疗组，提示索拉非尼可能通过抑制SLC3A2蛋白对半胱氨酸的转运而抑制GSH的合成，导致Gpx4的表达下降(图5k)。
图5 体内和体外铁死亡逆转化疗耐药
总之，研究团队报道了一种铁死亡诱导的纳米反应器，它通过双通道有效地积聚在肿瘤部位。释放的AFG通过参与磷脂过氧化过程，持续催化产生高细胞毒性·OH，进而诱导LPO的形成；索拉非尼抑制SLC3A2蛋白对胱氨酸的转运，导致GSH耗竭，Gpx4失活，进而引起铁死亡。深入分析表明，铁死亡导致细胞内氧化还原水平紊乱，有效下调P-gp、Gpx4和SLC3A2的表达，从而逆转化疗耐药，使细胞对索拉非尼持续敏感。铁死亡诱导的纳米反应器通过双通道逆转化疗耐药性，有效地抑制肿瘤生长。
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