不容错过！人工制备环状RNA的策略

环状RNA介绍及应用概述

新冠疫情加速mRNA疫苗的发展，多款疫苗的加速获批推动了mRNA核酸药物的创新之路。1976年，Sanger等人首次在植物病毒中鉴定出了一类单链共价闭合的环状RNA分子，2012年以来随着高通量测序技术的发展，近十年间大量具有功能的环状RNA不断涌现。共价闭合的环状结构可以保护环状RNA不受核酸外切酶的降解，环状RNA与mRNA相比拥有更加稳定的结构。环状RNA通过非帽依赖的方式翻译蛋白质，作为mRNA 2.0，为开发相对于mRNA更加高效的疫苗提供了可能。

环状RNA同样拥有mRNA疫苗相较于传统疫苗的优势，可以实现生产的标准化，通过序列的优化即可开发新的产品，大大的降低了生产的成本。环状RNA还具有比mRNA更加稳定的结构，可以耐受RNA酶的降解，大大降低了保存和运输的成本；由于环状RNA具有天然的稳定结构，使其不需核苷酸修饰即可高翻译蛋白，避免机体内先天免疫的影响。

环状RNA人工制备的方法

环状RNA技术替代mRNA优势明显，产业化前景光明，如何实现环状RNA的人工制备是环状RNA发挥作用的关键。目前，有三类常用的环状RNA人工制备方法，包括Ⅰ型内含子（T4 bacteriophage或Anabaena）自剪切、Ⅱ型内含子自剪切和T4 RNA连接酶方法。

1.Ⅰ型内含子（T4 bacteriophage或Anabaena）自剪切:

此前，Ⅰ型内含子自剪切的方式已被广泛用于体外环化短的RNA序列，58至124 nt的环化效率高达80%以上，但是对于长序列（1500nt以上）的环化效率无法达到量产要求[1]。Y Grace Chen和Wesselhoeft等人使用两种内含子自剪切的方式，利用内含子自剪接人工制备环状RNA，分别引入了74 nt 和186 nt的噬菌体和鱼腥藻外显子序列[2,3,4]。通过设计一个自剪接内含子，以及合理设计有助于剪接的普遍存在的辅助序列（同源臂，辅助外显子片段E1+E2，如图1a，b），在体外有效环化长度1500nt以上的RNA。2022年初，魏文胜教授使用图1方法人工制备环状RNA疫苗，并验证了环状RNA新冠疫苗在小鼠和恒河猴身上针对变种新冠病毒的保护作用[4]。另外通过序列优化设计利用T4 bacteriophage在体外可以做到无外源序列残留的环状RNA制备（如图2），但此种方法制备环状RNA效率低，暂不能满足工业化需求[5]。

图1.  I型内含子自剪切系统框架设计

2. Ⅱ型内含子自剪切:

如图3所示，利用来自酵母菌Ⅱ型内含子的自催化剪接反应可以在体外人工制备环状RNA，利用Ⅱ型内含子的六个结构区域中的（D1-D3）以及（D5-D6）序列倒转，可以形成自剪接活性的核酶，可在体外制备环状RNA，此种方法制备的环状RNA没有外来序列的残留，但制备效率低，目前很难进行工业化制备[6]。

如图4所示，用破伤风杆菌Ⅱ型内含子的自催化剪接反应也可以体外人工制备环状RNA，天然的破伤风杆菌Ⅱ型内含子的自催化剪切会将PIE系统中多余序列引入到目标分子中，通过序列设计破伤风杆菌Ⅱ型内含子剪切系统也可以和酵母菌Ⅱ型内含子剪切系统一样做到无外源序列残留的环状RNA制备，但无外源序列残留的环状RNA制备效率有待提高[7]。

3.序列重设计体外制备环状RNA：

如图5所示，传统方法用T4 DNA或T4 RNA连接酶借助夹板序列可以实现体外环状RNA制备，但制备效率低纯化工艺难，很难实现工业化制备。来自中国海洋大学的梁兴国教授原创性基础研究发现，通过计算机模拟RNA结构，寻找最适RNA环化的断口，可以实现无需额外夹板链或辅助链进行RNA的环化，本方法可显著抑制成环过程大分子副产物的产生,制备效率高达93%[8]。本方法可以让原来难以或不能环化的RNA序列可以高效环化。环化接口序列重设计的制备理念不但适用T4连接酶制备，还兼容适合内含子自剪切系统体外高效制备环状RNA。

环状RNA人工制备——工具酶

体外环状RNA的制备工艺已趋于成熟，其中规模化生产过程中主要涉及的工具酶有T7耐热RNA聚合酶、T4 RNA连接酶1/2、ssRNA环化酶、circGFP、circLuc标准品等，酶的灵活使用极大的方便生产流程，加速环状RNA的应用转化和产业化。

同时，消除线性RNA残余的干扰，是人工制备高纯度环状RNA的关键。环状RNA耐受Rnase R消化，高效的Rnase R可以完全清除线性RNA，Rnase R不仅是连接酶法环状RNA人工制备的关键原料，在内含子剪切的环状RNA人工制备方法中也是必不可少的。

T7耐热RNA聚合酶

T7耐热RNA聚合酶可在更高的温度下进行体外转录。它可在37~52℃条件下进行高效的体外转录，最佳温度为37℃，50℃反应条件下仍然保留60%以上的活性，而野生型在此温度下无活性。在20 µL标准体系中，以1 µg本试剂的Control template为模板可产生150~200 µg的产物，转录长度可达5000 nt。

吉赛自主研发的T7高产耐热型RNA合成试剂盒可在体外高效合成多种类型的RNA，如mRNA、lncRNA、shRNA等。

应用：利用该试剂盒得到的RNA适用于多种下游应用，如RNA结构和功能研究、反义RNA及RNAi实验、微阵列分析、显微注射、体外翻译和RNA疫苗等。

T4 RNA连接酶1

T4 RNA Ligase 1，即T4 RNA连接酶1（T4 Rnl 1），是一种依赖ATP的可以催化单链RNA、单链DNA或单核苷酸分子间或分子内5'-P末端与3'-OH末端之间形成磷酸二酯键的酶。

应用：可用于ssRNA的分子间连接；ssRNA与ssDNA的分子间连接；ssRNA 3′-OH末端用放射性同位素5’-[ 32P]pCp等的标记；单链Oligo RNA及Oligo DNA的合成；tRNA的特别修饰；在蛋白质中引入非天然氨基酸等。

T4 RNA连接酶2

T4 RNA Ligase 2，即T4 RNA连接酶2（T4 Rnl 2），是一种ATP依赖的双链RNA连接酶(double-strand RNA ligase，dsRNA Ligase)，可以用于双链RNA进行分子内的环化连接和分子间的线性连接。T4 RNA Ligase 2与T4 RNA Ligase 1（R0502）不同的是，对双链RNA中的nick的连接活性要大大高于对单链RNA末端的连接活性。

T4 RNA Ligase 2也可用于双链核酸（RNA双链、RNA/DNA杂合链或DNA双链）分子内或分子间RNA链的3’羟基和DNA链的5’磷酸基的连接。T4 RNA Ligase 2连接时需要5’磷酸和3’羟基的存在，可以是RNA链或DNA链的5’磷酸基和RNA链的3’羟基之间发生连接反应。

应用：主要用于连接双链RNA中缺刻的连接（即双链RNA的粘端连接），也可用于双链结构中，RNA 3’羟基与DNA 5’磷酸基的缺刻连接。

ssRNA环化酶

ssRNA Cyclase是一种耐热连接酶，可催化单链DNA（ssDNA）和单链RNA（ssRNA）底物的离子分子连接（即环化），这些底物同时具有5’-单磷酸和3’-羟基。大于15个碱基的线性ssDNAs和ssRNAs被ssRNA Cyclase环状化。环化反应中，要求催化底物单链 DNA/RNA 具有5’-磷酸基团和3’-OH 基团。对于大于15 nt 的单链底物，该酶都能高效的连接。

应用：ssRNA Cyclase能生产用于滚环复制或滚环转录实验和NGS的单链DNA模板以及生产大于15 nt环状RNA。

环状RNA标准品（circGFP和circLuc）

为满足circRNA领域对标准品的迫切需求，吉赛生物利用自身技术优势，推出2款circRNA标准品CircGFP、CircLuc。

CircGFP能够在真核细胞中高效进行GFP蛋白翻译。下图为使用制备的CircGFP转染293T细胞的案例。

上：明场。下：荧光。

CircLuc能够在真核细胞中高效进行荧光素酶的翻译。下图为使用制备的CircLuc转染293T细胞的案例。

RNase R

RNase R (Ribonuclease R)是一种来源于大肠杆菌RNR超家族的3’-5’核糖核酸外切酶，可从3’-5’方向将RNA逐步切割成二核苷酸和三核苷酸。RNase R可消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。

应用：RNase R常用于基因表达和可变剪切研究，可消化线性RNA以使环形RNA (circRNAs)或套索结构RNA (lariat RNA)得到富集。

参考文献

[1].Puttaraju, M., and Been, M.D. (1992). Group I permuted intron-exon (PIE)

sequences self-splice to produce circular exons. Nucleic Acids Res. 20, 5357–5364

[2].Chen, Y.G., Kim, M.V., Chen, X., Batista, P.J., Aoyama, S., Wilusz, J.E., Iwasaki, A., and Chang, H.Y. (2017). Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol. Cell 67, 228–238.e5.

[3].Wesselhoeft, R.A., Kowalski, P.S., Parker-Hale, F.C., Huang, Y., Bisaria, N., and Anderson, D.G. (2019). RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo. Mol. Cell 74, 508–520.e4

[4].Qu, L., Yi, Z., Shen, Y., Lin, L., Chen, F., Xu, Y., Wu, Z., Tang, H., Zhang, X., Tian, F., Wang, C., Xiao, X., Dong, X., Guo, L., Lu, S., Yang, C., Tang, C., Yang, Y., Yu, W., Wang, J., Zhou, Y., Huang, Q., Yisimayi, A., Liu, S., Huang, W., Cao, Y., Wang, Y., Zhou, Z., Peng, X., Wang, J., Xie, X.S., Wei, W., Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants, Cell (2022), doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.044.

[5].Rausch, J. W., Heinz, W. F., Payea, M. J., Sherpa, C., Gorospe, M., and Le Grice, S. F.

J. (2021). Characterizing and Circumventing Sequence Restrictions for Synthesis of Circular RNA In Vitro. Nucleic Acids Res. 49, E35. doi:10.1093/nar/gkaa1256

[6].CJarrell, K. A. (1993). Inverse Splicing of a Group II Intron. Proc. Natl. Acad. Sci. 90,

8624–8627. doi:10.1073/pnas.90.18.8624

[7].Chuyun Chen, Huanhuan Wei, Kai Zhang, Zeyang Li, Tong Wei, Chenxiang Tang, Yun Yang, Zefeng Wang. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2022.05.31.494115

[8].Chen, H., Cheng, K., Liu, X., An, R., Komiyama, M., and Liang, X. (2020a). Preferential Production of RNA Rings by T4 RNA Ligase 2 without Any Splint through Rational Design of Precursor Strand. Nucleic Acids Res. 48, e54. doi:10.1093/nar/gkaa181