聊聊兰尼碱/ryanodine受体2型（3）：如何调控一只内钙释放通道【不正经科普】

重要提示：建议读完上一篇再阅读本文，因为本文用到了大量上篇中的背景知识；为简便起见，此前出现过的术语（包括缩写）将不再展开英文全称。

    某种意义上，本系列的正文现在才开始，因为我终于要细说RyR2的调控啦！之前说过，本文中将出现上一篇提到的多数蛋白，外加一位重要的新朋友——β-肾上腺素受体信号通路。闲话少说，我们要聊的第一个小伙伴位于胞质侧，它是最早被发现的RyR2调控因子之一，也是功能最具争议的之一。它就是大名鼎鼎的FKBP12.6，此刻正蜷缩在某个RyR2为它提供的结合位点当中向我们问好。

    FKBP12.6有个跟它长得很像的小兄弟叫FKBP12（数字的含义也是分子量），这俩都是100多氨基酸的小蛋白，前者主要调控RyR2，后者主要调控RyR1，——至少有些研究是这样认为的。它们俩属于亲免素（immunophilin），能与某些免疫抑制剂高效结合，比如雷帕霉素（rapamycin），以及给了它们名字的FK506（也叫他克莫司，tacrolimus）。像其他亲免素一样，FKBP家成员都有肽基脯氨酰顺反异构酶（peptidylprolyl isomerase）活性，FKBP12和12.6也不例外。这类酶催化的反应超出了本系列的讨论范围，重要的是它对某些蛋白（可以包括它们自己）的正常折叠有着重要影响。不知道它俩这一功能会不会跟RyR2的调控有关系？

    言归正传。FKBP12.6对RyR2亲和力巨高，它的小兄弟FKBP12对RyR1的亲和力亦然，以至于后者就是因老是与RyR1一起纯化出来才被发现的。分离纯化时RyR1要经历不知多少艰难险阻，只有FKBP12对它不离不弃，它俩的亲和力可见一斑。不过，FKBP12对RyR2就冷淡得多了。尽管如此，有人发现心肌内FKBP12浓度比FKBP12.6高，平时大鼠和小鼠心肌中只有10%~20%左右的RyR2是跟FKBP12.6结合的，所以它俩贡献谁多谁少还难说呢。一般认为，FKBP12.6对RyR2的作用可以用“稳定”二字概括，就是说它能防止RyR2在不该开放的时候开放。令人一言难尽的是，许多确凿的证据支持这一观点，但也有几乎同样有力的证据提出异议，甚至怀疑FKBP12.6到底对RyR2有多大作用。即使在那些同意FKBP12.6对RyR2至关重要的研究当中，观察到的它对RyR2的具体作用也可以大相径庭。只说做个FKBP12.6敲除的小鼠模型吧，不同的研究就能敲出不同的花样：有的小鼠心脏结构正常，平时心电图也正常，应激时表现出心律失常；有的小鼠没有运动诱导的心律失常，但表现出雄性特异的心脏肥大；还有的小鼠更过分，居然啥事儿没有，它们心肌RyR2的功能也正常得很。不同品系小鼠遗传背景的差异大概对此有贡献，然而回头你就会看到遗传背景也不见得能解释所有的不一致性。RyR2的单通道实验更多地支持FKBP12.6能稳定RyR2的观点，可生物体毕竟是个复杂系统，想用单通道体外实验的结果来解释生理现象——尤其是当生理现象如此充满争议时——到底是件相当难的事。

    比起敲除模型，有关FKBP12.6过表达模型的争议还算少，真是谢天谢地。在兔子或小鼠的心肌过表达FKBP12.6后，舒张期钙火花的频率、振幅和持续时间都减少，提示RyR2的自发开放受到抑制。同时，SR（肌质网）储钙量升高，可能是因为舒张期从RyR2漏到胞质里的钙变少了。此外，收缩期钙瞬变振幅上升，收缩力因而增强，或许跟SR钙储量升高有关系。除细胞模型之外，还有人做出了只在心肌过表达FKBP12.6的小鼠模型。这些小鼠心肌的舒张期钙火花频率降低了50%、平均振幅和持续时间反而略有增加，SR钙储量基本不变，收缩期钙瞬变振幅反倒下降了30%。恼人的不一致性似乎从未缺席。不过，研究者们还发现，相比野生型小鼠，过表达小鼠更难被异丙肾上腺素注射+快速起搏诱发出心律失常。看到这儿你或许会眼前一亮，想将之归因于FKBP12.6对RyR2的稳定作用。然而，LTCC（L型钙通道）和NCX（钠钙交换体）也受到了FKBP12.6过表达的影响——前者电流密度峰值降低了15%，后者蛋白水平下降了18%，而这些都能影响诱发心律失常的难易。总之，现在多数证据倾向于支持FKBP12.6对RyR2具有稳定作用，但还是丢不得那句老话：“尚需更多研究。”

    至此，我所说的所有FKBP12.6的事大都是发生在它和“平常”的RyR2间的。难道还有不平常的RyR2吗？当然有。如果你还记得上一篇中那幅RyR2超复合体示意图的话，或许能想起图上那个RyR2其中一个亚基上标了两个磷酸化位点。人RyR2这俩位点是2808号和2814号丝氨酸（S2808和S2814），分别是PKA（蛋白激酶A）和CaMKII（钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II）的磷酸化位点。此外，PKA也能磷酸化2031号丝氨酸（S2031）。RyR2是四聚体，你可以想象一下它每个亚基上三个位点磷酸化状态的排列组合。尽管很难精确定义，工作中的RyR2可以粗略分为低磷酸化和高磷酸化两种状态。前者就是我说的“平常”RyR2，在FKBP12.6等因子的调节下，它们秉持中庸之道，释放的钙既不太少又不过多。后者则多出现在“不平常”的情况下，其时RyR2们变得活跃起来，开放概率（Po）增高、对胞浆钙的激活更敏感，释放更多的钙。有证据显示FKBP12.6更容易与此状态下的RyR2解离，而这可能在某些心脏疾病的发生发展中起到作用。

    说了半天，这“不平常”的状态到底是啥引起的呢？或许你早就猜到了，它就是心肌受到儿茶酚胺刺激的情况，具体点是β受体激活时的情况。（心肌也有α受体，但本文不谈它。）众所周知，我们体内担任化学信使的儿茶酚胺类物质有多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素，其中常跟心肌碰面的是后两个，都能激动β受体。学过药理或生理的都知道工作心肌的β受体主要是β1亚型，不过书本很少提到正常情况下β1和β2受体的含量比约为7:3。β2好像也不少嘛。它俩下游信号通路不尽相同，本文不讨论。话说β1受体激活后，跟它偶联的Ga蛋白麻利地活化腺苷酸环化酶，胞内cAMP浓度骤升。这些cAMP结合到PKA的调节亚基上，使催化亚基与之解离并激活。另一方面，β受体通路的运作（包括PKA的作用）和心率的上升都可以使心肌胞质钙浓度增加，进而激活酶如其名的CaMKII。要是钙浓度升高的时间再长一点儿，CaMKII还可以磷酸化它自己，活性变得更持久。这俩激酶能磷酸化超多东西，底物范围有不小的重叠，且作用可以很相似。这一切都使得严格地区分它们各自的作用无比困难，且有时可能意义不大。除RyR2外，它俩比较有名的底物包括LTCC和受磷蛋白（PLN）。磷酸化对LTCC的影响是增强电流，对PLN则使它失去抑制肌质网钙泵SERCA2a的能力，相当于提高了SR装载钙的效率，除适应更高频率的动作电位外还增加了库存钙量，变相增强收缩力。不过，要是钙释放跟不上节奏，只靠SERCA2a的努力也没什么用。这时候就该我们的RyR2出场了。

    其实我前面撒了个谎，因为已鉴定出的PKA磷酸化位点不止S2808和S2031两个，不过这两个是最主要的。多数证据支持PKA对RyR2的磷酸化整体上具有激活性的作用，在单通道层面表现为提高电导、提高Po（开放概率）、增加RyR2对胞质钙的敏感性等等，在整个ECC（兴奋-收缩偶联）层面则可表现为增加舒张期钙火花的频率、大小和同步程度、提高钙释放分数（fractional Ca2+ release, 从SR释出的钙占原来SR钙量的比例）、提高RyR2的偶联保真度（coupling fidelity, LTCC的开放成功诱发一朵钙火花的概率），等等。不过PKA在争议这方面也不是盏省油的灯，比如有人就没观察到PKA对ECC有明显影响，还有报道PKA激活后钙释放分数不变甚至降低的。有单通道实验观察到被PKA磷酸化了的RyR2会出现“适应”现象，也就是开放频率增加，但每次开放后关闭变快，结果稳态Po是降低的。由于兰尼碱结合试验测的是稳态Po，测定Po方法的不同（兰尼碱结合or单通道电流）或许是某些不一致性的来源。CaMKII在生理作用细节上的表现也没那么让人省心，单通道研究报道它提高Po的和降低Po的都有，后者还是跟激活性的效果（让RyR2不能被镁离子抑制）一同出现的。上升到细胞层面，对离体心肌的实验发现CaMKII能够增加舒张期的钙渗漏而PKA不能，用专门的抑制肽降低它的活性可以让收缩期SR钙释放和舒张期钙火花都减少。也有人用组成型激活（即一直激活的）的CaMKII做实验，发现这货反倒抑制RyR2活性，钙火花、钙瞬变也都受到了打压。研究者推测这现象源于某些机制对CaMKII过分激活的代偿，算是防止ECC失稳的保险。虽说只是个猜想，它提醒了我们一点，那就是真正的心肌内钙调控系统是非常复杂的，有些不一致性说不定就是这种复杂性的反映。不过再怎么说，大多数经典方式得到的证据还是支持PKA和CaMKII对RyR2以及ECC整体都有激活性作用，不然儿茶酚胺活化它俩干吗呢。近来结构生物学家们也对这俩激酶和RyR2之间的爱恨情仇产生了兴趣，并贡献了不少有趣的研究结果，比如有人发现PKA的磷酸化可以让关闭的RyR2变构为“我准备好了”的（primed）Po更高的状态，再比如关于CaMKII对S2814的磷酸化能让PKA对S2808的兴趣更强的那档子事。原文的总结图是这样的，我放到这儿主要是为了让各位看一下这两个激酶的真实样子（尽管PKA只有一部分）：

    话说到结构研究，我个人觉得最好玩的还真不是这些个跟磷酸化有关的东西，而是冷冻电镜和晶体学研究联手贡献的有关CaM-RyR2间互作的内容。CaM正名钙调蛋白，是个万金油级别的胞内钙感受器，跟钙但凡有点儿关系的地方基本都能见到它的身影。很显然，RyR2跟钙的关系之深厚可不能用有点儿来形容，它也好心地在自己身上为CaM的结合留出了位置，每个亚基不多不少结合一个。CaM貌如杠铃，两头各有一对能结合钙的EF手相，对钙的亲和力还挺高。无论结没结合钙，CaM都是RyR2超复合体的常驻组分，它能稳定RyR2的关闭状态，结合钙时效果最好。有趣的是，手里没钙的CaM（接下来称作apo-CaM）和有钙在身的CaM（接下来称作Ca-CaM）跟RyR2互作的方式是不一样的，这直接导致了它俩对RyR2抑制效果的差异。Apo-CaM的N端与名叫BSolB的结构域结合，C端结合在JSol和CSol的交界处，而Ca-CaM的结合基本只涉及CSol。你可能会说这都是啥结构域啊，上篇那图里怎么没有？？？别慌，换了个命名法而已，我换它主要是因为我参考的文章用的是这堆名字（……）。这里的BSolB、JSol和CSol分别全称桥接螺线管B（第一个B是bridging, Sol是solenoid）、连接螺线管（J是junctional）和核心螺线管（C是core）结构域，它们分别对应的是之前那图里的HD1、handle domain和central domain，另外还有个BSolC对应HD2。完整一套新命名法及对应的3D示意图我放在下面了，有兴趣的可以细看，没兴趣的可以直接跳到第3张图看CaM跟RyR2结合的细节。

    话说回来。从上面第2张图可以看出CSol杵在孔道上方，宛如RyR2体内的守门人。得益于这个位置，它能与RyR2的跨膜部分发生很多相互作用，对通道开闭的控制尤为重要。Ca-CaM直接与CSol互作，诱导其发生构象变化，使之与S6跨膜螺旋的相互作用改变，让通道倾向于关闭。Apo-CaM离CSol更远，很可能跟它的稳定作用更弱有关。这个互作中有一个有趣的细节，虽然已经在上一篇里提到过了，但我还是忍不住再说一下。这个细节出自一项X射线晶体学研究，把包含RyR2第三个CaM结合位点（Ca-CaM结合于此，另两个是给apo-CaM的）的蛋白片段和Ca-CaM一起结晶了。得到的结构显示，Ca-CaM与RyR2互作时结合有五个钙离子，多出来的那个钙位于“杠铃”的中间，81号天冬氨酸（D81）和85号谷氨酸（E85）参与了它的结合。为了检查这个钙是不是结晶时混进来的没有生理学意义的东西，研究者把E85突变为侧链不带电的丙氨酸，发现突变的CaM在无法结合第五个钙的同时，与RyR2的结合也减弱，说明这个钙可能真的有用。

    总之，无论出自费心的功能研究还是养眼的结构研究，已有越来越多的证据表明CaM是一个重要的RyR2稳定因子，某种意义上算是FKBP12.6的同行，但说实话有关它研究的一致性可比这位同行高太多了。FKBP12.6的异常解离被认为在许多获得性或先天性的病理过程中起着作用，最近这个说法被推广到了CaM身上，而且有不错的证据作为支撑。至此，我们已经把在学界最引人注目的胞质侧调控机制聊了个遍。让我们稍事休息，然后启程前往SR内，拜见我自己期待已久的“SR四天王”——集钙蛋白2（Casq2）、富含组氨酸的钙结合蛋白（HRC）、三联蛋白（triadin）与交界蛋白（junctin）。它们间及它们与RyR2间的关系复杂到催人泪下，根本没法分开讲，所以我打算从我最喜欢的Casq2开始，由它带出它自己与另三个小伙伴的复杂故事。

    Casq家有两位已知成员，大哥Casq1在骨骼肌与RyR家老大为伴，小弟Casq2则在心肌陪着RyR家老二，编号恰巧两两对得上。Casq2是个糖蛋白，切完19氨基酸的信号肽后全长380个氨基酸。它很对得起“收集钙的蛋白”这个名字，承包了心肌SR大部分钙缓冲工作，含量比HRC或钙网蛋白（calreticulin）等同行多得多。它对钙亲和力不高，但它有容乃大，一分子就能结合40~50个钙。这正是一个缓冲剂的基本素养：周围钙多时就将其结合在自己身上，周围钙少时就将结合的钙迅速释放出来。每次钙瞬变期间SR只释放35~40%的钙而不会被榨干，主要也是Casq2的功劳。它结合这么多钙靠的不是什么基序，而是大量带负电荷的氨基酸。接近些观察的话，你会发现这家伙与钙的关系不是一般地紧密。如果周围一丁点钙都没有，Casq2是没法折叠成型的，只能是一团乱糟糟的肽链。周围钙浓度逐渐上升时，它会先部分折叠进入熔球（molten globule）态，再在钙的诱导下完全折叠，变成三叶草的形状。故事到此并没有结束：如果继续增加钙，Casq2会先面对面（指通过N端相互作用）地形成二聚体，然后二聚体背靠背（指通过C端相互作用）地两两形成四聚体乃至更多聚体，最终产物是纤维状的N聚体。单体们互相结合的方式使多聚体内部存在一条与外部溶液相通的通道，钙可以结合在里面；单体与单体的结合处会形成带负电的口袋，钙照样能钻进去；而就算只看单体，折叠成型的单体内部各结构域的交界处也容纳有钙离子，它们起到了将各结构域组织在一起的桥梁作用。结果，抱团的Casq2平均每分子的缓冲能力强于单体，而折叠好了的单体的缓冲能力又强于不完全折叠的单体，可以用“结合越多钙，越能结合钙”来形容。这一连串变构相当奇妙，也是让我不可自拔地喜欢上Casq2的诱因之一。工作心肌中，Casq2在交界区SR富集，是单体、二聚体和多聚体的混合物。它的存在形式随钙浓度的变化而变化，除了被动地反映局部钙浓度之外，还主动地影响着其他蛋白们的活动。这些蛋白中自然包括RyR2。

    作为钙缓冲剂的扛把子，Casq2调控RyR2的最直观方式可能非缓冲钙离子莫属。这有什么用呢？最容易想到的可能是，钙缓冲剂的存在能使SR轻松地储存巨量钙：若SR容积不变而钙缓冲剂减少，则由于SERCA2a力量有限，SR的储钙量将降低。Casq2过表达的心肌SR储钙量显著增加，也侧面印证了这一点。另一方面，由于代偿机制的存在，就算Casq2没了，SR储钙量也真不一定有多大变化。但代偿机制不可能完全替代Casq2的功能，所以Casq2完蛋后，SR的钙缓冲能力肯定降低。有点像缺少缓冲剂的溶液pH值对酸或碱的加入十分敏感，钙缓冲能力的下降将使SR内游离钙浓度的震荡更加猛烈，主要体现在舒张期SR装载时游离钙浓度上升速度显著加快。要知道RyR2是要感知SR内钙的，这些翻江倒海的钙会让它神经过敏，一个不小心就SOICR（钙库超载诱导的钙释放）了。此中细节我们未来再说，之所以在此先提及，是因为我觉得思考钙缓冲缺陷的后果对理解钙缓冲的作用有很大的帮助。（遗传学传统艺能：认识一样东西最快的方法就是看看把这东西搞砸的后果。）

    缓冲无疑是Casq2工作中的重要方面，不过正如我剧透过的那样，钙缓冲蛋白的作用可不止缓冲钙离子。作为RyR2的好基友，Casq2的兼职就是以相对直接的方式调控RyR2，整体来说起抑制性作用。它可能具有两种调节RyR2的方式，一种是通过与RyR2直接互作来调控RyR2，另一种则是通过与其他RyR2结合蛋白互作间接调控RyR2。直接互作的最早证据来自对Casq1研究结果的外推，直到近年才有人确定了Casq2应该是能直接结合RyR2的，通过C末端小尾巴与RyR2跨膜部分的第一个SR腔内环相互作用。至于间接作用么，这就说来话长了，毕竟它牵扯到其他的调控因子。看起来三联蛋白和交界蛋白出场的时候到了。

    先说一点，这俩货都没有标准译名，我习惯用英文名称呼它俩（之前的文章也是），但今后我打算在本系列里使用我随便翻译的这俩名字。它们是外貌相似的单次跨膜蛋白，C端的长尾巴伸入SR腔内，C端尾巴和N端尾巴都可以与RyR2互作。三联蛋白和交界蛋白的名字都与肌肉有关，分别取自骨骼肌的三联管和交界区SR的“交界”，这暗示着它们广泛分布于肌肉中，骨骼肌与心肌都有。此处插播一件趣闻，那就是交界蛋白的基因名听起来与它没有半毛钱关系，叫ASPH。这桩怪事起因于可变剪接：ASPH mRNA有几个剪接变体翻译出来的东东有天冬氨酸β-羟化酶（aspartate β-hydroxylase, 缩写ASPH）活性，另一些没有，而交界蛋白属于后者。三联蛋白的基因名TRDN还算比较科学，它也因可变剪接而存在不同的亚型，心肌的亚型主要是三联蛋白-1。目前已发现剪接因子SRp38参与调控TRDN转录物的可变剪接。这个因子是一张庞大调控网络的一部分，与诸如肌膜相关蛋白（一类尾部锚定的膜蛋白）、早期生长应答-1（是个转录因子）之类的其他成员一起一丝不苟地组织着内钙调控蛋白们的共表达。内钙调控蛋白们的表达如此井井有条、恰到好处，要感谢它们的贡献；而内钙调控蛋白们各自的功能“剪不断、理还乱”，也得拜它们所赐。

    言归正传。三联&交界蛋白的一大爱好便是勾搭RyR2和Casq2，后者常被叫做“把Casq2锚定在RyR2上”，可能对将Casq2定位在交界区SR有作用。这俩用来勾搭Casq2的是C端尾巴上的若干KEKE基序，因富含赖氨酸（K）和谷氨酸（E）而得名。凭借着它，三联&交界蛋白能结合Casq2，能结合RyR2，还能结合HRC——SR四天王忽然齐了。Casq2的结合与钙浓度相关，钙极少时没法结合（没折叠好怎么结合），钙浓度超过5mM后也会逐渐解离。当然喽，只确定哪些蛋白在互作还不够，重要的是它们的互作有什么用。先说交界蛋白吧，一项单通道研究发现在胞质侧加入它的N端片段可使RyR2活性提高5倍，在SR腔侧加入C端片段使RyR2活性降低50%，完整蛋白则令RyR2的活性提高3倍，整体表现为激活。对离体心肌的研究则发现，SR内钙浓度低时（＜1mM）交界蛋白的缺失抑制SR钙释放，SR内钙浓度高时（比如β受体活化后）它的缺失则激活RyR2，增加舒张期钙释放。敲除交界蛋白的心肌平时SR钙库存更多、舒张期钙渗漏更少，钙火花更少但更亮（释放的钙多），β受体活化后钙火花频率和钙瞬变振幅的增幅更明显，舒张期钙渗漏反而更显著，很容易让人联想到“又激活又抑制”的效果。考虑到交界蛋白滚掉后还有三联蛋白、Casq2等调控因子，很难说上述的双面作用就反映了交界蛋白或交界蛋白-Casq2复合体自己的性质，不过巧的是它和那项单通道研究都观察到了交界蛋白对RyR2的激活效应。同样的激活效应也出现在了三联蛋白与RyR2的互作中，证据主要来自单通道实验和过表达模型（但也有争议）。有趣的是，单通道实验里Casq2与它俩的结合可以解除这种激活效应。基于这些结果，最早的对于这仨作用的猜想认为三联&交界蛋白对RyR2具有激活作用，Casq2与之结合后激活效果解除，仿若一个三元钙感受器，借Casq2的来去感知钙浓度的信息，实时调控RyR2的活性。这个猜想听来很棒，然而更多研究显示三联&交界蛋白的作用比想象中复杂得多，尤其是它俩中的前者。事实上，越来越多的证据支持三联蛋白与交界蛋白具有不同的主要功能：交界蛋白以较为直接的方式调节RyR2的活性，尽管人们对它的具体生理作用所知甚少；而三联蛋白则主要参与二联间隙微结构的维持，以及组织其他钙调控蛋白们的表达。这就把我们带回到了上一段末尾。

    如前所述，相当一部分心肌内钙调控蛋白各自的表达环环相扣，类似于牵一发而动全身的情况并不少见。比方说，三联蛋白敲除之后，RyR2、Casq2、交界蛋白、亲交界蛋白（junctophilin, JPH）-1和-2的表达水平分别下降了50%、60%、92%和30~40%（俩JPH一块儿算），而不处于交界区SR的蛋白，像SERCA2a、PLN、LTCC和NCX等则没什么变化。Casq2不但含量下降，而且难以正确地定位到交界区SR，结果会有大量Casq2迷失在纵行SR内，真是祸不单行。上边的生面孔JPH是个结构蛋白，N端借与磷脂结合锚定在T管质膜上，C端以疏水α螺旋插入交界区SR膜，像柔韧牢固的缆绳一样把二者联系在一起，对二联间隙结构的维持至关重要。三联蛋白缺失后二联间隙结构翻天覆地的变化，或许就与JPH表达的下调有关。怎么个翻天覆地呢？瞧瞧：没了三联蛋白，心肌中交界区SR膜与T管膜在空间上的紧密联系顿时少了50%——能形成二联间隙的空间一下子少了一半！这使约50%的LTCC找不到RyR2作伴，无法得到来自RyR2的钙对它们的负反馈抑制，结果内向钙电流增强，SR钙储量增大（输入多了）。同时，大把大把的RyR2也找不着LTCC，对它们而言内向钙电流再强也没用，结果就出现了SR钙储量上升、CICR却受抑制的矛盾一幕。篇幅所限，我对三联蛋白敲除后果的描述到此为止，不过这已经足以说明三联蛋白与二联间隙结构维持的关系。另一边，交界蛋白的敲除对其他交界区SR蛋白没什么影响，这再次暗示了它俩在功能上的差异，以及在那张我想象中的调控网络中位置的不同。

    说到这里，本文准备谈到的所有蛋白中只剩HRC没有正经露一手了。它在学界的地位一直有点尴尬，我猜主要是因为占绝对数量优势且与遗传病明确相关的Casq2抢光了钙缓冲蛋白的风头。很多研究RyR2的人都不特别关注HRC，但我认为它的作用应该受到重视。刚巧它能与三联蛋白互作，我就把它放在了SR四天王的组合里面，让它出出风头。像Casq2一样，HRC靠带负电的表面结合钙离子（它还能结合锌离子，这点Casq2办不到），会因钙的结合而发生构象变化及寡聚化、多聚化。正常SR内钙浓度下，它似乎主要是多聚体，不过钙浓度极高时它反倒变成单体。现在学界对HRC与RyR2功能之间的关系研究较少，其中我觉得最好玩的研究之前已经讲过了。如果你忘了的话，它大概是这样的：有人在敲除Casq2的基础上再敲除HRC，猜测由此而来SR内钙缓冲功能的进一步恶化会把心肌祸祸得比只敲Casq2更惨，谁知结果跟他们的预测背道而驰。他们提出的新猜想是：Casq2对RyR2有抑制作用，HRC对RyR2有激活作用，所以两个都无了（不太稳定的新平衡）比少一个（失衡）要好。HRC是否能与RyR2直接互作仍有争议，但它与三联蛋白的互作几乎毋庸置疑。这个互作的强度也与钙浓度有关，它在钙浓度较为中庸时最强，钙更多或更少时则被削弱。有趣的是，HRC也能跟SERCA2a互作，这一互作在钙浓度很低时最强，随着钙浓度升高单调递减，对SERCA2a似乎起抑制作用。我好像能想象出HRC随着SR内局部钙浓度的变化在RyR2和SERCA2a两边跑的样子了。鉴于现在对HRC与RyR2之间关系的研究实在不多，而且这次聊天的时间已经够长了，有关HRC的事儿就先聊到这。要是你觉得不够尽兴的话，别着急，回头或许我们还能见到它。

    本次闲聊已经接近尾声，然而本系列对RyR2调控的探究实际上才刚刚开始。毕竟RyR2调控实在是个宏大而又复杂的领域，随便从上文挑一个蛋白都够写上好几篇每篇几万字的综述，不消说你也猜得出本文因篇幅限制略去了不知多少有趣的东西。比如说，FKBP12对RyR2有什么用？到底什么叫“高磷酸化”？为什么SR内钙缓冲能力下降就容易发生SOICR？Casq2会不会也像三联蛋白那样参与交界区SR蛋白表达的调控或二联间隙结构的维持？试图回答如此难题的人们往往不能局限于对正常情况的研究，而得通过研究异常状况获得对正常功能的见解。今后闲聊的主题将从生理学转向病理生理学，这方面的研究成果除了能帮我们更好地了解生理状态下的RyR2调控之外，还对医疗研究颇有助益。我们将遇见的第一个病理生理学情境是臭名昭著的心力衰竭。考虑到钙对心肌的舒缩无比重要，RyR2的异常与心衰相关听起来一点都不令人惊奇，不过与此相关的研究成果却总是充满惊喜。做好准备喽，我们下回见。

    没法详细列出的资料来源包括维基百科以及GenBank、GeneCard、UniProt、HGNC等数据库。本文中出现的3个RyR2磷酸化位点的标号在不同物种的RyR2中不同，此处按我的习惯使用的是人RyR2的编号。我最开始本来没打算费工夫去查的，没想到文献里用得相当随意，几篇看下来我自己都搞不清哪个是哪个了，只好去PhosphoSite确认了一下。（后来本着不怕一万就怕万一的精神，我又去UniProt对着人RyR2的序列数了一下，确认那三个位号的氨基酸都是丝氨酸后才彻底放心。）

参考文献&拓展阅读：

Blayney, LM., and Lai, FA. Ryanodine receptor-mediated arrhythmias and sudden cardiac death. Pharmacol Ther 123, 151-177 (2009). DOI: 10.1016/j.pharmthera.2009.03.006

备注：享有置顶待遇的本系列常驻嘉宾。

Wleklinski, MJ., Kannankeril, PJ., and Knollmann, BC. Molecular and tissue mechanisms of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. J Physiol 598, 2817-2834 (2020). DOI: 10.1113/JP276757

备注：封面图出处，画风我很喜欢。

Yano, M., Yamamoto, T., Kobayashi, S., and Matsuzaki, M. Role of ryanodine receptor as a Ca2+ regulatory center in normal and failing hearts. J Cardiol 53, 1-7 (2009). DOI: 10.1016/j.jjcc.2008.10.008

备注：头图出处。

Gonano, LA., and Jones, PP. FK506-binding proteins 12 and 12.6 (FKBPs) as regulators of cardiac ryanodine receptors: Insights from new functional and structural knowledge. Channels 11, 415-425 (2017). DOI: 10.1080/19336950.2017.1344799

备注：相当一部分有关FKBP的内容以及那张FKBP与RyR2结合的图的出处。

Guo, T., Cornea, RL., Huke, S., Camors, E., Yang, Y., Picht, E., Fruen, BR., and Bers, DM. Kinetics of FKBP12.6 Binding to Ryanodine Receptors in Permeabilized Cardiac Myocytes and Effects on Ca Sparks. Circ Res 106, 1743-1752 (2010). DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.110.219816

备注：对于FKBP12和12.6与RyR2结合状况的研究。这里边发现平时只有10~20%RyR2与FKBP12.6结合（因为它少），但几乎所有FKBP12.6都是与RyR2结合的（因为亲和力高），不过只有FKBP12.6能抑制RyR2的基础活性（就是没有儿茶酚胺之类的刺激它时的活性）。

Gellen, B., Fernández-Velasco, M., Briec, F., Vinet, L., LeQuang, K., Rouet-Benzineb, P., Bénitah, JP., Pezet, M., Palais, G., Pellegrin, N., Zhang, A., Perrier, R., Escoubet, B., Marniquet, X., Richard, S., Jaisser, F., Gómez, AM., Charpentier, F., and Mercadier, JJ. Conditional FKBP12.6 Overexpression in Mouse Cardiac Myocytes Prevents Triggered Ventricular Tachycardia Through Specific Alterations in Excitation- Contraction Coupling. Circulation 117, 1778-1786 (2008). DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.107.731893

备注：FKBP12.6条件过表达（只在心肌过表达）研究的出处。

Miotto, MC., Weninger, G., Dridi, H., Yuan, Q., Liu, Y., Wronska, A., Melville, Z., Sittenfeld, L., Reiken, S., and Marks, AR. Structural analyses of human ryanodine receptor type 2 channels reveal the mechanisms for sudden cardiac death and treatment. Sci Adv 8, eabo1272 (2022). DOI: 10.1126/sciadv.abo1272

备注：PKA对RyR2作用的结构研究，话说这篇里边那张总结性的图（Figure6）挺好看的。

Haji-Ghassemi, O., Yuchi, Z., and Van Petegem, F. The Cardiac Ryanodine Receptor Phosphorylation Hotspot Embraces PKA in a Phosphorylation-Dependent Manner. Mol Cell 75, 39-52 (2019). DOI: 10.1016/j.molcel.2019.04.019

备注：有关于CaMKII磷酸化S2814能促进PKA磷酸化S2808的那篇研究，以及相关图片出处。

Fowler, ED., and Zissimopoulos, S. Molecular, Subcellular, and Arrhythmogenic Mechanisms in Genetic RyR2 Disease. Biomolecules 12, 1030 (2022). DOI: 10.3390/biom12081030

备注：新命名法、新命名法那两张图及部分CaM相关内容的出处。对了，这篇综述比较短但很有意思，内容相当全面（尽管没涉及那么多细节），推荐一读。

Ogawa, H., Kurebayashi, N., Yamazawa, T., and Murayama, T. Regulatory mechanisms of ryanodine receptor/Ca2+ release channel revealed by recent advancements in structural studies. J Muscle Res Cell M 42, 291-304 (2021). DOI: 10.1007/s10974-020-09575-6

备注：CaM结合前后位移那张图的出处。

Yu Q., Anderson, DE., Kaur, R., Fisher, AJ., and Ames, JB. The Crystal Structure of Calmodulin Bound to the Cardiac Ryanodine Receptor (RyR2) at Residues Phe4246–Val4271 Reveals a Fifth Calcium Binding Site. Biochemistry 60, 1088-1096 (2021). DOI: 10.1021/acs.biochem.1c00152

备注：有关于CaM第5个钙结合位点的所有内容（包括那张图）的出处。话说上一篇也提到了这个内容，然而我忘记在上一篇里引用它了……

Wang, Q., Paskevicius, T., Filbert, A., Qin, W., Kim, HJ., Chen, XZ., Tang, J., Dacks, JB., Agellon, LB., and Michalak, M. Phylogenetic and biochemical analysis of calsequestrin structure and association of its variants with cardiac disorders. Sci Rep 10, 18115 (2020). DOI: 10.1038/s41598-020-75097-3

备注：Casq在进化树上不同物种中分布那张图的出处。我每次看到这张图都有把它打出来贴在我床头或其他什么地方的墙上当海报的冲动。（到底是因为实在喜欢Casq2啊！(ﾉ≧∀≦)ﾉ 它应该是我第二喜欢的蛋白了，第一喜欢的当然是RyR2~）

Faggioni, M., and Knollmann, BC. Calsequestrin 2 and arrhythmias. Am J Physiol Heart Circ Physiol 302, H1250-H1260 (2012). DOI: 10.1152/ajpheart.00779.2011

Sibbles, ET., Waddell, HMM., Mereacre, V., Jones, PP., Munro, ML. The function and regulation of calsequestrin-2: implications in calcium-mediated arrhythmias. Biophys Rev 14, 329-352 (2022). DOI: 10.1007/s12551-021-00914-6

备注：有关Casq2的大部分内容的出处，第二篇也是那幅《Casq2变形记》关于Casq2构象变化的图的出处。话说这两篇文章刚好隔了10年……

Titus, EW., Deiter, FH., Shi, C., Wojciak, J., Scheinman, M., Jura, N., and Deo, RC. The structure of a calsequestrin filament reveals mechanisms of familial arrhythmia. Nat Struct Mol Biol 27, 1142–1151 (2020). DOI: 10.1038/s41594-020-0510-9

备注：Casq多聚体结构那张图的出处。

Chopra, N., and Knollmann, BC. Triadin regulates cardiac muscle couplon structure and microdomain Ca2+ signalling: a path towards ventricular arrhythmias. Cardiovasc Res 98, 187-191 (2013). DOI: 10.1093/cvr/cvt023

Dulhunty, A., Wei, L., and Beard, N. Junctin - the quiet achiever. J Physiol 587, 3135-3137 (2009). DOI: 10.1113/jphysiol.2009.171959

备注：有关三联蛋白和交界蛋白的大部分内容的出处，第一篇文章也是三联蛋白敲除前后二联间隙结构变化那张图的出处。由于它们之间那复杂的关系，名字里讲三联蛋白的第一篇也讲到了交界蛋白，第二篇则也讲到了三联蛋白。

Li, L., Mirza, S., Richardson, SJ., Gallant, EM., Thekkedam, C., Pace, SM., Zorzato, F., Liu, D., Beard, NA., Dulhunty, AF. A new cytoplasmic interaction between junctin and ryanodine receptor Ca2+ release channels. J Cell Sci 128, 951-963 (2015). DOI: 10.1242/jcs.160689

备注：交界蛋白的N、C端片段及完整蛋白与RyR2互作的单通道研究具体数据出处。

Arvanitis, DA., Vafiadaki, E., Sanoudou, D., and Kranias, EG. Histidine-rich calcium binding protein: The new regulator of sarcoplasmic reticulum calcium cycling. J Mol Cell Cardiol 50, 43-49 (2011). DOI: 10.1016/j.yjmcc.2010.08.021

备注：与HRC相关的大部分内容的出处。

    好了，我要去继续啃有关于RyR2和心力衰竭的文献了……不知道什么时候再见喽_(:з」∠)_