转染与Co-IP

一、转染流程

jetPrime

1.待细胞长到60%-80%时开始转染。

2.先将Buffer和质粒震荡混匀。

3.加入转染试剂（质粒：转染试剂=1：2，例如0.8μg质粒加1.6μL的转染试剂），震荡混匀。

4.室温静置10min。

5.将混合物加入细胞中。

Lip3000

质粒：p3000：lip3000=1：2：2，例如0.8μg质粒加1.6μL的p3000，1.6μL的lip3000

1.待细胞长到60%-80%时开始转染。

2.将质粒和p3000（质粒：p3000=1：2，例如0.8μg质粒加1.6μL的p3000）加入Opti-MEM中，震荡混匀，静置5min。

3.将lip3000（质粒：lip3000=1：2，例如0.8μg质粒加1.6μL的lip3000）加入Opti-MEM中，震荡混匀，静置5min。

4.将上述两管混合，涡旋震荡混匀。

5.室温静置10-15min。

6.将混合物加入细胞中。

二、Co-IP

以HA-X和FLAG-Y为例

HA-X + - +

FLAG-Y - + +

1.中瓶细胞长满之后铺于小皿中，一个中瓶铺6个小皿。

2.待细胞长到60%-80%时开始转染，2个质粒各转4μg，总共转8μg质粒。

3.转染步骤参考上文。

收样

转染后36-30h收样

1.每个小皿加2mL预冷的PBS洗涤，弃尽。

2.加700μL裂解液，摇匀后冰上静置3-5min，将细胞和裂解液转移至新的1.5mLEp管中。

3.4℃，将Ep管放在摇转仪上裂解30min。

4.4℃，10000rpm，离心10min，收集上清。

吸取50μL上清加入5×loding buffer用于全细胞检测。

其余用于下一步。

5.上清中加入1.5μL一抗（单抗），4℃冰箱慢速旋转过夜。

6.加入30μL充分重悬的protein A+G agarose，4℃冰箱旋转裂解4-6h。

7.4℃，3000rpm离心5min，小心弃去上清，宁可残存少量上清也勿吸到Agarose。

8.样品中加入1mL裂解液，4℃冰箱快速旋转洗涤珠子2次，每次洗涤8min。洗涤时离心条件和吸除上清要求同上步骤7.

完成最后一次洗涤之后，去除上清。把5×Loading buffer用裂解液配制成60μL 1×Loading buffer，加入Ep管中重悬珠子，煮样，-20℃保存备用。